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Annexins蛋白是一类受Ca2+调节、能够与带负电荷的膜磷脂结合的蛋白家族,在许多原核和真核细胞中广泛表达。AnnexinⅡ(AnxA2,A2)作为Annexin家族的重要成员,于1979年被Rade和Martin首先发现。AnxA2多表达于内皮细胞、单核巨噬细胞、神经细胞和某些肿瘤细胞,在细胞膜、细胞质、细胞核和胞外均有表达。AnxA2蛋白在细胞内以单体和异四聚体两种形式存在。AnxA2单体由保守的C端和可变的N端组成,可与蛋白质配体P11蛋白(又名S100A10)形成异四聚体,执行其与生物膜结构相关的一系列功能。AnxA2蛋白参与了众多生物学活动,在细胞膜构架的形成,膜聚合、内吞和胞吐,纤溶系统的稳定等生理活动中均扮演重要角色。AnxA2还参与某些病理过程,与心血管疾病、血液病、感染、肿瘤等多种疾病相关。无论在胞内还是胞外, AnxA2都具有广泛的功能,对其的研究也受到越来越多的关注。一、AnxA2单抗的制备及功能研究研究表明AnxA2的胞外区是t-PA和plasminagen的共受体,在纤溶活性的诱导过程中起重要作用,并是多种病毒、炎症介质的受体,在病毒感染,炎症活动中起一定作用,因此,制备针对AnxA2的胞外区的单克隆抗体对研究AnxA2在各种生理病理状态下的功能具有重要意义。利用本科室已经建立起来的杂交瘤技术,将重组AnxA2蛋白经次氮基三乙酸镍琼脂糖(Ni-NTAagarose)柱纯化浓缩后免疫Balb/c小鼠,尾静脉加强后取脾细胞融合,ELISA法筛选阳性克隆,制备腹水。运用Western blot对抗体进行鉴定观察抗体与原核重组蛋白反应情况。结果可以看出:小鼠脾细胞与杂交瘤细胞融合后筛选获得两株持续分泌单克隆抗体的细胞株,命名为SZ-135,SZ-136。该株杂交瘤细胞单克隆后接种小鼠腹腔产生腹水,腹水经蛋白G-Sephrose4B亲和层析柱纯化。SZ-135,SZ-136单抗能特异性识别相对分子量为36kD的重组蛋白。同时SZ-135可以有效抑制HMEC-1体外的血管形成。二、AnxA2在多发性骨髓瘤及各类血液病中的异常表达及机制研究1. AnxA2在多发性骨髓瘤及各类血液病中的异常表达AnxA2表达异常与人类许多疾病的发生发展相关,在多种类型的肿瘤中都可观察到AnxA2的表达异常。国外近年的研究表明,AnxA2在APL细胞膜表面的高表达与其原发性纤溶亢进有关,但在MM及其它类型的血液病中的表达却少有报道。在我们的实验中,通过应用流式细胞仪检测了6例骨髓瘤病人和6例正常人浆细胞表面AnxA2表达,明确了骨髓瘤病人浆细胞表面AnxA2表达明显高于正常人。通过real-time PCR、Western blot、流式细胞仪检测U266和NB4、RPMI8226、XG7、Jurkat、Raji、U937、K562共8类血液病细胞株AnxA2表达,明确了骨髓瘤细胞株U266在mRNA、总蛋白、膜表面蛋白不同水平均较其它血液病细胞株高表达AnxA2。骨髓瘤细胞株RPMI8226在总蛋白水平亦高表达AnxA2。2. AnxA2基因对骨髓瘤U266、RPMI8226细胞增殖、凋亡、侵袭力及细胞因子的影响为了了解AnxA2基因对骨髓瘤U266、RPMI8226细胞增殖、凋亡、侵袭力及细胞因子的影响,我们应用RNAi技术进行研究。首先,采用siRNA转染人骨髓瘤U266、RPMI8226细胞,应用real-time PCR、Western blot和流式细胞术鉴定干扰效果。继而应用MTT法检测siRNA对细胞增殖的作用,应用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,应用Transwell板检测细胞侵袭力,应用real-time PCR检测对血管新生、凋亡、侵袭等相关基因的影响。结果表明,AnxA2siRNA转染U266和RPMI8226细胞均对细胞增殖起抑制作用(P<0.05),并可诱导细胞凋亡增加(P<0.05),明显降低细胞侵袭力(P<0.05),同时降低血管新生相关因子VEGF-C、VEGF-R2,侵袭相关因子MMP-2、MMP-9、MT1-MMP和TIMP-2的表达。由此我们认为:siRNA沉默AnxA2基因可抑制U266和RPMI8226细胞增殖、侵袭,诱导凋亡增加,降低血管新生、侵袭相关因子的表达。三、各类药物对血液病细胞株AnxA2表达的影响1.AnxA2与沙利度胺、地塞米松诱导骨髓瘤病人血栓形成的相关性为了了解沙利度胺(thalidomide)、地塞米松(Dexamethasone,DXM)在体外对人多发性骨髓瘤(Multiple myeloma MM)细胞株RPMI8226、人微血管内皮细胞株HMEC-1、人静脉内皮细胞株EAHY926中AnxA2基因表达的调节作用,探讨AnxA2基因与沙利度胺、地塞米松诱发骨髓瘤病人血栓形成的相关性。我们在体外培养上述细胞,real time PCR检测在不同浓度下沙利度胺及地塞米松对三种细胞株AnxA2基因表达的影响,流式细胞仪、激光共聚焦检测对三种细胞株膜表面AnxA2蛋白表达的影响,细胞促纤溶活性实验检测对三种细胞株膜表面纤溶酶活性的影响。结果表明,12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml沙利度胺,2.5μg/ml地塞米松,25μg/ml沙利度胺加2.5μg/ml地塞米松均能诱导RPMI8226、HMEC-1、Eahy926细胞株AnxA2mRNA和蛋白表达下降(P<0.05)。AnxA2抗体、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml沙利度胺,2.5μg/ml地塞米松,25μg/ml沙利度胺加2.5μg/ml地塞米松均能诱导RPMI8226、HMEC-1、Eahy926细胞株纤溶活性下降(P<0.05),差异有统计学意义。故我们认为,沙利度胺和地塞米松能抑制RPMI8226、HMEC-1、Eahy926细胞株AnxA2mRNA和蛋白表达。由于AnxA2为t-PA和PLA的共受体,具促纤溶作用,沙利度胺和地塞米松通过下调AnxA2,抗纤溶,可能为其诱发MM血栓形成的原因之一。2.AS2O3通过下调AnxA2抑制NB4细胞侵袭力为了研究三氧化二砷(Arsenic trioxide ,AS2O3)是否可通过下调AnxA2抑制人急性早幼粒白血病细胞(NB4)侵袭力的作用。我们在体外培养NB4细胞,并通过流式细胞仪检测不同浓度AS2O3对NB4细胞膜表面AnxA2蛋白表达的影响,Transwell板检测AnxA2抗体和AS2O3对NB4细胞侵袭力的影响。结果表明AS2O3在0.31μg/ml,0.63μg/ml,1.25μg/ml浓度均能诱导NB4细胞膜表面AnxA2蛋白水平表达下降(P<0.05),存在剂量依赖性;AnxA2抗体在0.01μg/ml,0.02μg/ml,0.04μg/ml浓度和AS2O3在0.31μg/ml,0.63μg/ml,1.25μg/ml浓度均抑制NB4细胞侵袭力下降(P<0.05),并有量效关系。因此我们认为AnxA2抗体可抑制NB4细胞侵袭力,AS2O3可通过下调AnxA2蛋白膜表面表达,抑制NB4细胞侵袭力。