论文部分内容阅读
细胞色素P450酶系,可写为P450s,对内、外源物质在生物体内发生的催化反应具有直接参与作用,如常见的脱硫化、环氧化、羟基化等,其中对脂肪酸ω或ω-1位置的羟基化催化反应极为典型,且不同长度的脂肪酸末端羟基化反应由不同的P450酶催化反应。10-HDA(10-羟基-2-癸烯酸),是一种中链、不饱和且仅存在于蜂王酸中的独特脂肪酸,不仅在医学上具有抗菌消炎、降血压血脂的作用,还被广泛用于化妆品和保健领域。但由于其来源单一,目前仅在蜂王浆中发现且含量极低,因此市场上出现供不应求的局面。而且,10-HDA的末端羟基作为除C=C之外的又一特殊官能团,其形成机理尚不明了,且对ω位置的羟基形成研究甚少,所以,研究10-HDA新的合成方法并实现工业化生产具有重要的研究意义和市场价值。前期已选用蛋白质组学的方法,探究表明蜜蜂CYP49A1及CYP9e2两种蛋白的表达与10-HDA合成关系密切,本研究依据于此,通过基因克隆和表达载体的构建最终获得可以表达蜜蜂上颚腺CYP49A1及CYP9e2两种外源蛋白的毕赤酵母酵母工程菌GS115/pPICZαA-Cyp49A1和GS115/pPICZαA-Cyp9e2,获得表达后,利用CO差光谱法测得CYP49A1和CYP9e2目的蛋白浓度分别为0.414nmol/mg和0.462 nmol/mg。本研究同时将蜜蜂NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)在大肠杆菌中进行表达,并以血红素过氧化酶为间接反应物,最终测得CPR蛋白酶的比活性为77.33(EU of CPR)/μg,为进一步构建体外反应酶系,研究CYP49A1和CYP9e2的生物活性奠定基础。在研究CYP49A1和CYP9e2对底物的羟基作用前,首先对其与底物的结合性进行了分析。研究发现CYP49A1与癸酸和月桂酸的解离常数Kd分别为7.9±0.7μM和6.1±0.6μM;CYP9e2与癸酸和月桂酸的解离常数Kd分别为7.6±0.5μM和5.2±0.4μM。通过构建P450酶生物活性体外检测体系,在分别添加底物癸烷、十二烷以及癸酸、月桂酸进行对目的蛋白的催化特性分析,气质联用分析得目的蛋白CYP49A1可将十二烷催化氧化成十二碳一元醇,CYP9e2可催化底物10-羟基癸酸发生羟基化,产物为2-羟基癸二酸。2-羟基癸二酸通过还原反应可将其10号位的羧基还原为羟基,得到2,10-二羟基癸酸,进一步发生消去反应在2号位上形成C=C,最终获得产物10-羟基-2-癸烯酸,即10-HDA。这对探究10-HDA为生物发酵合成法具有重要的理论指导意义,为未来实现10-HDA工业化生产探明突破方向。