溶杆菌属由Christensen和Cook在1978年建立分类,属于黄单胞科,γ-变形菌门。溶杆菌在不同的栖息地普遍存在,如海洋、土壤、沥青坑、污泥堆肥、火山灰以及水生环境。溶杆菌具有独特的特征,如65-72%的高G+C含量、无鞭毛、滑行运动,产生大量胞外水解酶及活性次级代谢产物。溶杆菌作为潜在的生防菌株和活性天然产物来源日益受到广泛关注。抗生素溶杆菌OH13分离于水稻根部土壤,对植物病原细菌和真菌展现了有效的生防活性。我们利用葡聚糖凝胶层析柱和高效液相色谱从抗生素溶杆菌OH 13中分离纯化了六种化合物。通过NMR和MS分析,这些化合物被鉴定为吩嗪类物质,分别为:(1)1-羟基-6-甲氧基-5,10-二氧吩嗪;(2) 1-羟基-6-甲氧基-10-氧基吩嗪;(3) 1,6-二羟基-5,10-二氧吩嗪;(4) 1,6-二甲氧基-10-氧基吩嗪;(5) 1,6-二甲氧基吩嗪;(6) 1-羟基-6-甲氧基吩嗪。化合物1-4为氮氧化吩嗪,其中化合物1与已报道的myxin结构一致,对多种微生物都具有很强的抗生素活性。化合物3为已知的抗生素iodinin,对于革兰氏阳性细菌和几种放线菌及真菌展现很强的抗生素活性。尽管化合物4和5已被化学合成,但其首次作为天然产物被发现。吩嗪类天然产物,因为其抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤活性已被广泛研究,特别是来自莽草酸途径的吩嗪-1-羧酸(PCA)和吩嗪-1,6-二羧酸(PDC)。一个保守的基因簇,phzABCDEFG,负责PCA和PDC的生物合成。PCA和PDC被认为是其它更复杂吩嗪物质的合成前体。然而对于氮氧化吩嗪的生物合成机制我们是知之甚少的,如myxin (1)和 iodinin (3)。除了氮氧化吩嗪,其它包含芳香族氮氧化基团的天然产物是非常稀少的,但通常具有很强的活性。芳香族氮氧化物因为其具有由生物还原激活的、缺氧选择性的DNA损伤特性,使得其成为很值得研究的一类抗肿瘤类化合物。然而,对于这些芳香族氮氧化物的氮氧化机制仍是不清楚的,因此我们对抗生素溶杆菌OH13中氮氧化吩嗪类物质的氮氧化机制进行研究。通过对OH13基因组进行生物信息学分析,我们发现一个包含10个基因的基因簇(LaPhz)可能负责吩嗪类物质的生物合成。这个LaPhz基因簇包含六个假定的核心基因,LaPhzB-G,以及四个假定的修饰基因, LaPhzNO1、LaPhzS、LaPhzX和 LaPhzM。为 了证明 LaPhz 基因簇负责OH13中吩嗪物质的生物合成,我们首先突变了三个核心基因,LaPhzC、LaPhzD和LaPhzB。HPLC分析其代谢产物,结果表明LaPhzC和LaPhzB突变体不能产生吩嗪类物质,而LaPhzD突变体产生非常少量的化合物2。突变体的活性检测与HPLC结果一致,LaaPhzC和LaPhzB突变体丧失了抗细菌活性,而LaaPhzD突变体仅有微弱的活性。这些结果证明LaPhz基因簇负责抗生素溶杆菌OH13中吩嗪类抗生素的生物合成。LaPhz基因簇中基因LaPhzNO1与编码环己酮单加氧酶的基因类似,这类酶是催化Baeyer-Villiger类型反应的含黄素蛋白。基因LaPhzNO1突变后,OH13不能产生氮氧化吩嗪,而另外两个非氮氧化的吩嗪物质产量却显著提高。进而我们在大肠杆菌中表达LaPhzNO1,通过体外酶活性检测,证明LaPhzNO1是依赖于NADPH并且含黄素的氮氧化酶。基因簇中LaPhzS,与另一个编码含黄素单加氧酶的PhzS同源,具有脱羧羟基化功能。LaPhzS突变体不能产生化合物1-6,但有PDC产生。这说明PDC是抗生素溶杆菌吩嗪类物质的合成前体物质。LaPhzS可将PDC转化为1,6-二羟基吩嗪。LaPhzNO1能氧化1,6-二羟基吩嗪为1,6-二羟基-5,10-二氧吩嗪(iodinin,3)。除吩嗪类物质外,LaPhzNO1还能催化8-羟基喹啉的氮氧化,这表明LaPhzNO1在化学酶法合成其它芳香族氮氧化物中具有潜在的应用价值。LaPhzNO1是第一个经过证明的杂环芳香族天然产物生物合成中的氮加氧酶。