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目的:
研究幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)CagL蛋白在体外对人胃黏膜上皮细胞(GES-1)生理功能的影响。制备CagL蛋白单克隆抗体（mAb），并鉴定其特性。
方法:
1.用IPTG诱导含pET-28a(+)-cagL表达载体的E.coliBL21(DE3)菌表达CagL融合蛋白，之后用Ni2+-NTA亲和层析法进行纯化;
2.用不同浓度CagL融合蛋白与GES-1进行共培养，运用显微镜观察其在不同时间段对细胞形态的影响;MTT法检测其对细胞增殖的影响;
3.收集不同时间、不同浓度CagL融合蛋白与GES-1共培养后的培养上清，用液相芯片分析技术检测培养上清中促炎细胞因子(IFNγ,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-10,IL-12p70，IL-13，TNF-a)的分泌情况;
4.用SPSSv19.0软件进行统计学分析;组间差异的比较采用多因素方差分析;
5.用纯化的CagL融合蛋白免疫BALB/c小鼠;利用细胞融合技术将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合获得杂交瘤细胞;通过数轮亚克隆和间接ELISA筛选能稳定分泌mAb的杂交瘤细胞;
6.腹腔接种阳性杂交瘤细胞于BALB/c小鼠，制备腹水型mAb，并进行纯化;
7.用ELISA法鉴定mAb的免疫球蛋白类型;间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清、腹水的抗体效价及其相对亲和力;相加ELISA法初步分析mAb识别表位的异同;间接ELISA法和Westernblot法鉴定mAb的反应特异性。
结果:
1.纯化的CagL融合蛋白经SDS-PAGE电泳，在预期的分子量32kDa处见特异目的条带，融合蛋白的纯度达到85％以上。
2.不同浓度CagL融合蛋白与GES-1细胞作用不同时间后，细胞形态发生明显变化，细胞增殖能力随蛋白浓度的增加和作用时间的延长而降低。
3.CagL融合蛋白能诱导GES-1细胞分泌部分促炎细胞因子，如IL-8、IL-6、IL-7、IL-12、TNF-a。
4.用CagL融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，血清多抗效价达1∶80000以上;经融合及亚克隆后共获得三株能稳定分泌抗CagL蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为HPL-1C9、HPL-2G10、HPL-3E6。
5.分别接种三株杂交瘤细胞于BALB/c小鼠，成功获取腹水。
6.获得两株IgM类和一株IgG2a类mAb;三株杂交瘤细胞上清的效价均在1∶64～1∶128之间;腹水效价在1∶16000以上相对亲和力较高;三株mAb识别的抗原表位各不相同;Westernblot鉴定结果表明三株mAb均能特异性结合CagL融合蛋白，其中能特异性结合H.pylori全菌蛋白及膜组分蛋白的有两株。
结论:
本研究结果显示，H.pyloriCagL融合蛋白对人胃黏膜GES-1细胞的增殖有一定的抑制作用，并能影响其细胞因子的分泌。通过细胞融合技术成功获得了三株分泌抗H.pyloriCagL单克隆抗体的杂交瘤细胞，且成功制备了腹水型mAbs;三株mAb分别为IgM和IgG2a类型，均有较高的效价及亲和力，其中两株mAb与H.pylori菌株有特异性。