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目的 柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CVA10)是近年来引起手足口病(Hand,foot and mouth disease HFMD)的主要病原体之一。而目前尚未有CVAI0特异性抗病毒药物和疫苗。疫苗是预防和控制的有效措施,但CVA10难以在非洲绿猴肾(African green monkey kidney,Vero)细胞等人用疫苗生产细胞基质中增殖培养的特性严重阻碍了 CVA10疫苗的相关研究。本研究通过筛选出Vero 细胞或人胚肺二倍体(Human embryonic lung diploid cell,KMB17)细胞适应的CVA10毒株,并对代表株进行一步生长曲线、乳鼠致病性以及灭活疫苗免-疫原性等部分生物学特性的初步探究,为CVA10疫苗及其相关作用机制的研究提供研究基础。方法1.通过收集2009年～2015年云南昆明地区及2017年湖北襄阳地区手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)病人粪便及肛拭子临床标本(共327份),并利用人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞、Vero细胞、KMB17细胞进行分离培养,对鉴定为CVA10的分离株进行基于全长VP1核酸序列的种系进化分析。2.分别在Vero细胞、KMB17细胞上对RD细胞分离株进行连续传代适应。3.选取病毒滴度高,且能代表不同基因亚型的四个病毒适应株进行蚀斑克隆纯化后,用微量组织培养技术(Micro tissue culture technique,MCT)检测接种细胞后不同时间点的病毒滴度,分别绘制四个代表株在Vero细胞和KMB17细胞上一步生长曲线。4.在3天龄BalB/C乳鼠模型中,以105TCID50颅腔攻毒后,记录乳鼠体重、临床打分、生存曲线,并取临床打分为3的乳鼠各组织进行病毒载量的检测(Real-time PCR Taqman探针法绝对定量)和组织石蜡切片的苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色、免疫组化等分析。5.超滤浓缩β-丙内酯灭活的V6-19/XY/CHN/2017病毒抗原后,免疫6～8周龄BalB/C成鼠,测定小鼠抗血清对不同代表株的中和抗体效价。6.在Vero细胞上连续传代代表毒株V6-19/XY/CHN/2017,并比较第1、5、10、15代全基因序列。7.通过RT-PCR分别扩增覆盖病毒株的全基因片段,确定四个代表株全基因核酸(氨基酸)序列。结果1.经三种细胞分离,仅在RD细胞获得14株CVA10分离株(检出率为5.2%),均为C基因型。2.经过Vero细胞和KMB17细胞分别传代适应,最终获得了 2株Vero细胞适应的CVA10毒株和11株KMB17细胞适应株。3.V6-19/XY/CHN/2017适应株对Vero细胞和KMB17细胞均具有较强敏感性,感染性滴度分别能达107.63TCID50/mL和107 32TCID50/mL。4.四个代表株均具有强烈的噬肌肉性,但毒力不同(K1554/YN/CHN/2015>V6-19/XY/CHN/2017>K975/YN/CHN/2010>K136/YN/CHN/2013)。5.用Vero细胞作为细胞基质制成的V6-19/XY/CHN/2017灭活疫苗能诱导成鼠体内产生较高效价的中和抗体(GMT=462),且对另三个KMB17代表株具有良好的交叉保护能力(GMT为266.4～401.7)。6.V6-19/XY/CHN/2017在Vero细胞上增殖15代内遗传稳定性良好。7.全基因核酸(氨基酸)的比较结果显示,四个代表株间核酸(氨基酸)同源性为91.5%～96.0%(98.4%～98.9%),而5’UTR和3’UTR同源性差别较大,分别为90.5%～97.4%和88.4%～97.6%,且编码的氨基酸序列中存在多个氨基酸位点差异。结论1.本研究中的CVA10分离株均为C基因型,与近几年中国内地流行株基因型一致。2.筛选到2株Vero细胞适应株和11株KMB17细胞适应的CVA10毒株。3.CVA10病毒株具有肌肉组织噬性。4.Vero细胞适应株V6-19/XY/CHN/2017具有良好的免疫原性,且遗传稳定性良好。本研究为CVA10疫苗研究及其相关作用机制的揭示提供了重要参考信息。