随着嗓音外科学的不断发展，嗓音外科医生可在显微镜下通过激光等方法切除声带不良病变，但术中易造成声带固有层损伤，导致固有层细胞外基质成分的含量及分布发生改变从而形成瘢痕。如何减少瘢痕的形成，一直是困扰研究人员的重要问题。既往有学者通过在动物声带内注射各种干细胞，如骨髓间充质干细胞、脂肪基质干细胞及胚胎干细胞等修复声带损伤，然而骨髓间充质干细胞取材时患者较为痛苦，不宜反复取材，脂肪基质干细胞虽易取材，但其组织来源与声带组织结构差异大，胚胎干细胞的应用仍存在伦理方面的问题等，因此限制了这些细胞在临床上的应用。近年来研究人员已证实在高等动物体内广泛存在着间充质干细胞，喉黏膜因其范围广，取材相对方便，且此部位细胞的组织来源与声带组织结构最为接近，不存在伦理方面的问题，因此我们设想喉黏膜中是否同样存在间充质干细胞。若能成功分离此种细胞，并将其用于喉部组织的缺损修复，将会为声带损伤的患者带来新的希望。因此前期实验中刘阳已成功从人喉黏膜中培养出具有快速增殖能力及多向分化潜能的间充质干细胞，命名为喉黏膜间充质干细胞(LM-MSCs)。本实验的研究目的是将LM-MSCs应用于动物实验，观察LM-MSCs在受损声带内的存活情况及转归，并在形态及组织学水平观察其对声带损伤的修复作用。1目的探讨犬喉黏膜中是否存在间充质干细胞，对其进行分离培养及鉴定，将其植入犬受损声带，观察LM-MSCs在声带内的存活及转归，并评估其对声带损伤的修复作用。2方法2.1犬喉黏膜间充质干细胞的分离培养及鉴定犬处死后取材，获取正常会厌舌侧黏膜，利用消化培养法获得黏膜固有层细胞，利用成脂、成骨、成软骨诱导液对其多向分化的能力进行研究，通过MTT实验、平板克隆形成试验观察LM-MSCs的生物学特性及通过流式细胞仪对LM-MSCs表面标志物进行检测分析。2.2犬声带激光损伤模型的建立中华田园犬5只，其中4只在支撑喉镜下挑起会厌显露双侧声带，局部喷少量利多卡因，半导体激光双侧对称性切除声带膜部中后1/3处，深度达甲杓肌，双侧对称，1只犬未损伤作为对照组。术后观察双侧声带的大体愈合情况，如充血、水肿、损伤表面的不规则性，有无萎缩及瘢痕形成。分别于术后4d、2w、4w及8w声带取材，左侧声带行石蜡切片(厚度约5μm)，HE染色观察声带损伤处炎性细胞侵润及纤维组织增生情况， Massontrichrome染色、Elastin VG染色、Alcian blue染色分别观察胶原纤维、弹力纤维、透明质酸的分布与含量变化，右侧声带行冰冻切片(厚度约5μm)并行纤维连接蛋白(Fibronectin)免疫组化染色观察fibronectin的含量变化。2.3喉黏膜间充质干细胞在声带急性损伤修复中作用的实验研究2.3.1喉黏膜间充质干细胞对声带大体愈合情况的影响取第3代LM-MSCs，Dil荧光染料标记后备用，中华田园犬10只，支撑喉镜下半导体激光损伤双侧声带膜部中后1/3，深度达甲杓肌，损伤后即行声带注射术，左侧声带注射0.2ml LM-MSCs与胶原的混合物(约含2×106个细胞)作为干细胞组，右侧声带仅注射0.2ml胶原作为对照组。对10只犬随机分组，1-6号犬分别于术后2w、4w及8w在支撑喉镜下观察受损声带愈合的情况，如充血、水肿、损伤表面的不规则性，有无萎缩及瘢痕形成。2.3.2喉黏膜间充质干细胞对声带固有层结构的影响将犬处死取材，行冰冻切片后，并行免疫组化染色观察fibronectin的含量变化，石蜡切片HE染色观察声带固有层炎性细胞侵润及纤维组织增生情况，并行Masson trichrome染色、EVG染色、Alcian blue染色观察声带固有层中胶原纤维、弹力纤维及透明质酸(HA)的排列及含量改变。2.3.3喉黏膜间充质干细胞在声带内存活的情况1-6号犬声带行冰冻切片后，用Hochest荧光染料衬染声带组织细胞核15min，PBS冲洗切片，荧光显微镜下观察植入的LM-MSCs在声带内存活及分布的情况，观察植入的LM-MSCs随时间的推移存活数量的变化。2.3.4喉黏膜间充质干细胞在声带内的转归术后4w及8w分别处死2只犬(7-10号)观察干细胞在声带内的转归，冰冻切片后行免疫荧光Vimentin染色及Smooth musle actin染色，二抗带FITC荧光，荧光显微镜下观察植入的LM-MSCs在声带组织中转化为成纤维细胞及肌成纤维细胞的能力，植入的LM-MSCs本身呈红色荧光，若在蓝光的激发下同时可呈绿色荧光，证明其可转化为成纤维细胞或肌成纤维细胞。3结果3.1喉黏膜间充质干细胞的分离培养及鉴定原代培养的LM-MSCs在3d左右贴壁生长，起初成短梭状，随后细胞伸展渐成长梭状，与成纤维细胞形态相似，胞核大。在体外分别经成脂、成骨和成软骨诱导分化后，油红O染色阳性，茜素红染色阳性，成软骨微团II型胶原免疫组化染色DAB显色可观察到阳性信号。培养的LM-MSCs增殖能力强，增殖过程中无停滞期，接种后第3d开始处于对数生长期，第7d达到生长峰值，第8d进入生长平台期。平板克隆形成试验结果示LM-MSCs有较高的克隆形成率约19.7%。通过流式细胞仪对LM-MSCs进行表面标志物的分析， LM-MSCs高表达间充质的表面分子标志(CD29-77.6%、CD44-75.5%、CD90-97.3%、CD105-38.3%)，不表达造血系的表面分子标志(CD34-1.8%、CD45-0.9%)。3.2犬声带激光损伤模型的建立术后4d支撑喉镜下双侧声带充血、水肿，肉芽组织形成，表面不规则，组织切片HE染色示上皮未被覆固有层，损伤处可见大量炎性细胞侵润，固有层与声带肌层界限不清，各种ECM成分不易检出。术后2w喉镜下见声带充血较前减轻，但仍有水肿，受损表面不规则，HE染色示新生上皮被覆受损部位，炎性细胞数量较前减少，大量纤维组织增生；ECM改变(根据切片IOD值检测)：fibronectin含量增加，胶原纤维增粗含量增加，排列紊乱，弹力纤维含量减少且变细，排列不齐，HA含量下降。术后4w喉镜可见双侧声带充血水肿基本消失，受损处表面不规则，萎缩形成，HE染色示固有层无炎性细胞侵润，且被致密的纤维组织所替代；ECM改变：fibronectin含量持续增加，胶原含量增加，排列紊乱，弹力纤维含量略下降，且排列不齐，HA含量下降。术后8w喉镜可见双侧声带无明显充血水肿，损伤表面不规则，局部萎缩，瘢痕修复；ECM改变：fibronectin含量略上升，胶原纤维呈粗大条索状，含量增加排且列紊乱，弹力纤维含量趋于稳定，HA含量下降。3.3喉黏膜间充质干细胞在声带急性损伤修复中作用的实验研究3.3.1喉黏膜间充质干细胞对声带大体愈合情况的影响术后2w可观察到双侧声带水肿，稍充血，表面不规则，且有肉芽形成，干细胞组声带肉芽形成较少，且声带表面较对照组规则；术后4w时双侧声带充血、水肿基本消失，表面稍不规则，肉芽组织不明显，萎缩形成，对照组声带表面不规则性及萎缩较干细胞组明显；术后8w时双侧声带无充血、水肿，无新生肉芽组织形成，声带损伤局部可见萎缩、瘢痕形成，对照组声带瘢痕较干细胞组大，且萎缩明显。3.3.2喉黏膜间充质干细胞对声带固有层结构的影响犬处死后声带取材并行组织切片观察，2w时干细胞组声带固有层内炎性细胞侵润及纤维组织增生要小于对照组；双侧声带fibronectin含量持续上升，干细胞组含量略低于对照组；双侧声带胶原含量增加，干细胞组的胶原纤维含量稍低于对照组，且排列上较对照组规则；双侧声带弹力纤维含量均减少，排列紊乱，干细胞组含量高于对照组；HA含量呈下降趋势，干细胞组含量略高于对照组。4w时双侧声带炎性细胞侵润基本消失，纤维组织增生，干细胞组增生小于对照组；双侧声带fibronectin上升，干细胞组含量低于对照组；胶原纤维呈条索状，含量持续增加，干细胞组较对照组含量低，排列较规则；弹力纤维含量继续下降，纤维直径变细，干细胞组含量稍高于对照组；HA含量下降，干细胞组含量略高于对照组。8w时双侧声带观察不到炎性细胞侵润，纤维组织增生明显；双侧声带fibronectin上升，对照组含量高于干细胞组；双侧声带胶原呈粗大条索状，含量增加，对照组较干细胞组排列紊乱；弹力纤维含量趋于稳定，干细胞组弹力纤维直径较对照组粗。HA含量持续降低，干细胞组含量高于对照组。3.3.3喉黏膜间充质干细胞在声带内的存活情况干细胞注射术后2w、4w及8w荧光显微镜下观察到植入的LM-MSCs在声带固有层内存活，2w时固有层内有大量红色荧光标记的细胞，提示此时有较多数量的移植细胞存活，4w时植入的LM-MSCs存活数量较2w时明显减少，8w时仍可观察到存活的LM-MSCs，但数量较前明显减少。3.3.4喉黏膜间充质干细胞在声带内的转归Vimentin免疫荧光染色，4w时荧光显微镜下一些呈红色荧光的LM-MSCs在蓝光的激发下同时可发出绿色荧光，提示植入的LM-MSCs可转化为成纤维细胞，同样的方法，8w时也可观察到一些植入的LM-MSCs转化为成纤维细胞。Smooth mucle actin免疫荧光染色，荧光显微镜下可见4w时植入的LM-MSCs在蓝光的激发下同时可发出绿色荧光，提示植入的LM-MSCs可转化为肌成纤维细胞，同样的方法，8w时未能观察到植入的LM-MSCs转化为肌成纤维细胞。4结论4.1本实验利用消化培养法成功培养并鉴定了犬喉黏膜间充质干细胞，证明了其具有向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化的能力。犬喉黏膜间充质干细胞具有有较快的生长增殖速度和较高的克隆形成能力，表达间充质干细胞表面标志物。4.2支撑喉镜下应用半导体激光造成犬声带膜部损伤，术后喉镜下可见2w时双侧声带充血水肿，4w时出现萎缩，8w时瘢痕形成，组织学示固有层内胶原含量持续上升，排列紊乱，提示大量瘢痕组织形成，弹力纤维含量下降示声带组织的弹性下降，HA含量降低示声带振动能力及抑制胶原无序沉积的能力下降，fibronectin含量增加示组织纤维化程度加重，以上结果表明本实验成功的建立了犬声带损伤模型，为后续损伤修复实验提供了可靠的动物模型。4.3.1喉黏膜间充质干细胞声带植入后，充血水肿较对照组轻。干细胞组声带表面较对照组规则，萎缩程度小，瘢痕形成少。4.3.2组织切片示喉黏膜间充质干细胞能降低固有层中胶原的沉积及无序排列，提高弹力纤维与HA含量以保证声带的有效振动，且具有抑制fibronectin含量上升以减少固有层纤维化的功能，以上结果表明喉黏膜间充质干细胞可通过调节细胞外基质成分的合成，改变微环境修复声带损伤。4.3.3荧光显微镜下植入的喉黏膜间充质干细胞主要分布于固有层中，术后2w、4w及8w均可观察到植入的LM-MSCs在声带内存活，但随着时间的推移，其存活数量逐渐减少。4.3.4荧光显微镜下植入的喉黏膜间充质干细胞在受损声带固有层内转化为成纤维细胞及肌成纤维细胞，提示LM-MSCs可通过直接转化为固有层自身细胞参与声带的损伤修复。