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根瘤菌是与豆科植物共生结瘤固氮的细菌,能够固定空气中的氮为宿主提供氮源,促进豆科植物生长发育。现代农业生产中,根瘤菌拌种提高豆科植物生产力已经成为一种常见的农业措施。然而由于宿主种类、根瘤菌种以及生物与非生物因素的影响,使得根瘤菌的结瘤能力千差万别,部分根瘤菌难以高效地与宿主植物结瘤固氮,难以达到应有的增产效果。因此如何提高根瘤菌的接种效率,一直是豆科植物固氮体系构建研究的热点。研究表明,根瘤菌可以内生于植物体内,并可运移至种子器官定殖,随种子的萌发而优先共生结瘤。但根瘤菌在侵染宿主以及侵染成功后侵入宿主体内时,会诱发植物防御反应,继而阻碍根瘤菌的侵入。研究发现根瘤菌侵染宿主以及侵入体内的过程中,分泌的次生代谢产物胞外多糖和吲哚乙酸(IAA)扮演着重要角色,它们可以减弱宿主的防御反应,促进根瘤菌的侵染以及侵入。据报道,添加外源硼可以促进根瘤菌的侵染和侵入。目前,对硼处理根瘤菌接种苜蓿后,根瘤菌侵入苜蓿体内的运移和定殖已有研究,但硼对根瘤菌分泌胞外多糖、IAA及菌体形态结构的影响尚不清楚。因此本研究以不同硼浓度(0(ck)、0.05、1、5、10和100 mg/L)处理根瘤菌Ensifer meliloti LZgn5f(gn5f)(内源根瘤菌,来源于供试材料)和Ensifer meliloti 12531f(12531f)(外源根瘤菌,来源于国家微生物保藏中心),筛选适宜硼浓度,并用此浓度处理两菌株,研究硼对两根瘤菌产胞外多糖、IAA以及菌体形态结构的影响。采用蛋白组学方法研究硼处理两根瘤菌蛋白表达差异变化,进一步阐明硼对根瘤菌胞外多糖及IAA分泌的调控机制。取得结果如下:1.添加100 mg/L硼有利于gn5f生长,1 mg/L硼有利于12531f生长;此外,100 mg/L硼处理根瘤菌gn5f、1 mg/L硼处理根瘤菌12531f,均可促进二者胞外多糖和IAA分泌量,改变根瘤菌菌体形态及表面结构。2.蛋白组学分析,100 mg/L硼处理根瘤菌gn5f,有7个蛋白表达上调,47个蛋白表达下调。功能分类将这些蛋白分为细胞过程(运输和分解代谢)、环境信息处理(膜运输)、遗传信息处理(转录)、代谢(全局和概览通路)以及其他未知功能蛋白5类,其中已知功能的上调蛋白NAD依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶和琥珀酸半醛脱氢酶[NADP(+)])均属于代谢(全局和概览通路)类功能蛋白。1 mg/L硼处理根瘤菌12531f,有3个蛋白表达上调,4个蛋白表达下调,它们可分为细胞过程(运输和分解代谢)、遗传信息处理(转录)、代谢(全局和概览通路)和其他未知功能蛋白4类,其中上调蛋白Uvr ABC系统蛋白B属于遗传信息处理(转录)类功能蛋白,天冬氨酸裂氨酶和CTP合酶属于代谢(全局和概览通路)类功能蛋白。3.根据差异蛋白表达富集的主要代谢通路分析,100 mg/L硼促进根瘤菌gn5f产胞外多糖和IAA的机制为:硼通过促进NAD依赖性琥珀酸半醛脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶、琥珀酸半醛脱氢酶[NADP(+)]等差异蛋白上调,继而促进丙酮酸代谢、GABA旁路代谢,谷氨酸代谢等与三羧酸循环有关的代谢通路,为胞外多糖合成提供能量及所需要的各种糖类物质(D-半乳糖残基,D-葡萄糖残基以及D-葡萄糖醛酸等),继而促进胞外多糖的合成;硼促进色氨酸的合成,然后色氨酸在相关酶的作用下经吲哚-3-乙酰胺(IAM)或吲哚-3-丙酮酸途径合成IAA,继而促进IAA的合成。1 mg/L硼促进根瘤菌12531f产胞外多糖和IAA的机制为:硼通过促进天冬氨酸裂氨酶和CTP合酶蛋白表达上调,促进三羧酸循环的中间产物延胡索酸的生成,继而促进三羧酸循环中某些代谢通路,合成胞外多糖的中间产物(单糖的重复单元)并且提供能量,单糖重复单元在非糖类残基(乙酰基、丙酮基和琥珀酰基等)修饰下合成胞外多糖。二氢硫辛酰胺脱氢酶蛋白表达下调抑制了吲哚-3-丙酮酸途径,间接促进了吲哚-3-乙酰胺(IAM)的形成,继而促进IAM转化成IAA。