肥胖已经成为全球范围最普通的一种代谢性疾病。它与许多疾病密切相关,包括高血压,2型糖尿病,胰岛素抵抗,高血脂,脂肪肝和癌症以及其他一些慢性疾病。本实验室前期开展了中药委陵菜抗糖尿病化学成分研究,发现主要活性成分委陵菜黄酮,进一步合成了一系列衍生物,发现黄酮衍生物Fla-CN具有明显的抗肥胖和抗糖尿病作用。本课题应用3T3-L1小鼠前脂肪细胞和人肝癌HepG2细胞,对黄酮衍生物Fla-CN的体外调节脂代谢作用进行评价,并对其调节脂代谢作用的分子机制进行研究,为后期药物筛选模型的选择和药物作用靶点研究提供实验依据。本文第一部分研究黄酮衍生物Fla-CN抑制脂肪生成作用及机制。实验结果发现Fla-CN作用于3T3-L1前脂肪细胞分化的早期阶段,剂量依赖性地抑制3T3-L1前脂肪细胞分化,降低细胞内脂质含量。Fla-CN显著上调3T3-L1前脂肪细胞分化过程中AMPK的磷酸化水平,Compound C部分阻断了Fla-CN对3T3-L1前脂肪细胞分化的抑制作用。Fla-CN显著上调细胞分化过程中miR-27a/b的表达水平,转染miR-27a/b抑制剂和同时以Compound C干预后,Fla-CN对3T3-L1前脂肪细胞分化的抑制作用被阻断。因此,Fla-CN通过激活AMPK和上调miR-27的表达抑制3T3-L1前脂肪细胞分化。Fla-CN能够明显抑制3T3-L1细胞分化过程中脂肪生成相关基因的mRNA表达水平,进一步抑制脂肪生成相关转录因子及脂肪特异性基因PPARγ,C/EBPα,SREBP-1c,FAS和aP2的蛋白表达水平。第二部分研究Fla-CN对成熟脂肪细胞脂肪分解的影响。Fla-CN能够显著促进3T3-L1成熟脂肪细胞甘油三酯水解,降低细胞内甘油三酯水平,增加细胞外甘油和游离脂肪酸的含量。Fla-CN能够上调分化成熟3T3-L1脂肪细胞AMPK和ACC的磷酸化水平,Compound C部分阻断了Fla-CN对成熟3T3-L1脂肪细胞甘油三酯水解的促进作用。Fla-CN能够上调成熟3T3-L1脂肪细胞内HSL和ATGL蛋白表达水平,促进甘油三酯的水解。因此,激活AMPK,进而上调HSL和ATGL的蛋白表达水平是Fla-CN促进脂肪细胞甘油三酯分解的作用机制之一。以转染mi R-29b/c模拟物/抑制物结合AMPK激动剂/抑制剂干预实验表明,miR-29b/c表达水平的变化不影响AMPK的蛋白表达及磷酸化水平,但AMPK的激活能够下调miR-29b/c的表达水平;Fla-CN通过激活AMPK促进脂肪分解,同时激活的AMPK下调mi R-29b/c的表达水平,通过其反馈回路进一步调节脂代谢平衡。第三部分研究Fla-CN对高糖诱导人肝癌HepG细胞脂肪生成的作用及机制。Fla-CN能够显著抑制高糖诱导HepG2细胞脂肪生成,降低细胞内脂质含量,并呈一定的剂量依赖性。以转染miR-122模拟物/抑制物结合AMPK激动剂/抑制剂干预实验显示,AICAR对miR-122的表达水平均无显著性影响,提示激活AMPK并不影响miR-122的表达水平;Fla-CN下调HepG2细胞miR-122的表达水平,而且以Compound C阻断AMPK的激活后,Fla-CN仍然显示了对mi R-122表达的下调作用,提示Fla-CN下调miR-122的表达不依赖于激活AMPK。另一方面,以Compound C阻断AMPK的激活后,油红染色显示Fla-CN仍然具有一定的抑制高糖诱导Hep G2细胞脂肪生成的作用。因此,Fla-CN通过激活AMPK和下调miR-122的表达,抑制高糖诱导HepG2细胞的脂肪生成。Fla-CN能够剂量依存性地下调高糖诱导HepG2细胞脂肪生成相关基因PPARγ,C/EBPα,SREBP-1c和FAS mRNA及其蛋白的表达水平,并且促进HepG2细胞脂肪酸氧化相关基因PPARα,PGC-1α和CPT-1αmRNA及其蛋白的表达水平,调节脂代谢。综上所述,本文通过AMPK激动剂/抑制剂干预,miR-27a/b、mi R-29b/c和miR-122模拟物/抑制物转染,首次阐明了黄酮衍生物Fla-CN通过激活AMPK和上调miR-27a/b的表达抑制3T3-L1前脂肪细胞分化,抑制脂肪生成;通过激活AMPK,进而下调miR-29b/c的表达水平,促进脂肪细胞脂肪分解,调节脂代谢。进一步在HepG肝细胞中,阐明了Fla-CN通过激活AMPK和下调mi R-122的表达水平,抑制高糖诱导HepG2细胞脂肪生成,调节肝细胞脂代谢。