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刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性寄生于几乎所有有核细胞内的寄生性原虫。所致弓形虫病已成为中国一种重要的食源性、人兽共患性寄生虫病。目前，弓形虫病治疗面临着副作用强、根治率低、耐药株出现等问题。寻找高效、低毒抗弓形虫药物一直是防治研究中的重点。
Sir2全称沉默信号调节因子2（Silent information regulator2），是一类高度保守的、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），属第三类HDAC家族—sirtuins家族。
Sir2蛋白最早发现于酵母细胞中，随后在多种原核、真核细胞中被证实。人体内，Sir2被命名为SIRT2。SIRT2既可定位胞浆，也可入核，对胞浆蛋白、组蛋白或转录因子进行去乙酰化修饰。然而，对于弓形虫体内是否存在Sir2蛋白以及其功能目前尚未见相关报道。因此，为了证实弓形虫体内存在Sir2蛋白、阐明其酶活性，进行了以下研究，从而为抗弓形虫药物研发提供理论基础。
目的：
1.找到弓形虫基因组中潜在的sir2基因。
2.检测TgSir2a与TgSir2b的去乙酰化酶活性。
3.探究TgSir2a与TgSir2b蛋白在虫体中的定位。
方法：
1.BLAST比对寻找弓形虫基因组中潜在的sir2基因
以酵母Sir2氨基酸序列为模板，通过Blast搜索ToxoDB数据库，利用SignalP预测信号肽，利用TMHMM-2.0预测跨膜区域，利用Clustal Omega进行序列比对。
2.检测TgSir2a和TgSir2b的去乙酰化酶活性
2.1体外表达TgSir2a蛋白
2.1.1原核表达TgSir2a蛋白
（1）重组质粒pET-28b-TgSir2a△1-15aa的构建与鉴定
提取虫体总RNA、逆转录成cDNA后，以cDNA为模板，PCR扩增TgSir2a去掉前15个氨基酸信号肽（TgSir2a△1-15aa）的编码序列，酶切、连接后构建原核表达质粒：pET-28b-TgSir2a△1-15aa。质粒经测序验证正确后进行后续实验。
（2）TgSir2a蛋白诱导表达、纯化与鉴定
将测序正确的pET-28b-TgSir2a△1-15aa重组质粒经转化、诱导、超声，获得诱导后的上清和沉淀，做考马斯亮蓝法染色和Western Blot进行鉴定，将沉淀用盐酸胍过夜处理，经离心、过滤，镍柱纯化，做考染鉴定。
2.1.2真核表达TgSir2a蛋白
（1）重组质粒pFastBac1-TgSir2a△1-15aa的构建与鉴定
提取虫体总RNA、逆转录成cDNA后，以cDNA为模板，PCR扩增TgSir2a△1-15aa，酶切、连接后构建真核表达质粒：pFastBac1-TgSir2a△1-15aa。将测序正确的质粒转化DH10Bac感受态，得到重组杆状病毒Bacmid质粒，经过蓝白斑筛选，将白色菌落送公司测序验证，测序正确后进行后续实验。
（2）TgSir2a重组蛋白的大量表达与鉴定
将测序正确的TgSir2重组杆状病毒Bacmid质粒转染入Sf9细胞并于28℃培养箱中培养，将获得的蛋白进行考马斯亮蓝染色和Western Blot实验验证。
2.2原核表达TgSir2b蛋白
（1）重组质粒pGEX-6p-1-TgSir2b的构建与鉴定
提取虫体总RNA、逆转录成cDNA后，以cDNA为模板，PCR扩增TgSir2b编码序列，酶切、连接后构建原核表达质粒：pGEX-6p-1-TgSir2b。质粒经测序验证正确后进行后续实验。
（2）TgSir2b蛋白诱导表达、纯化与鉴定
将测序正确的GST-TgSir2b重组质粒经转化、诱导、超声，获得诱导后的上清和沉淀，做考马斯亮蓝法染色和Western Blot进行鉴定，将沉淀用盐酸胍过夜处理，经离心、过滤，Glutathione-SepharoseTM4B介质纯化，做考染鉴定。
2.3弓形虫去乙酰化酶TgSir2a和TgSir2b酶活性的检测
通过使用Epigenas?Universal SIRT Activity/Inhibition Assay Kit(Colormetric)试剂盒检测原核、真核表达的TgSir2a与原核表达的TgSir2b的去乙酰化酶活性。
3.探究TgSir2a和TgSir2b蛋白在速殖子增殖周期中的定位
3.1TgSir2a抗体的制备及验证
将纯化后的HIS-TgSir2a△1-15aa融合蛋白背部皮下多点注射免疫2只新西兰大白兔，共免疫3次，免疫结束后，采集兔血清，用弓形虫全虫蛋白和纯化的His-TgSir2a△1-15aa蛋白作为样品，用获得的血清作为一抗进行验证。用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测免疫后兔血清抗体效价。
3.2TgSir2b抗体的制备及验证
将制备好的TgSir2b的多肽背部皮下多点注射免疫5只BALB/c小鼠，共免疫3次，免疫结束后，采集鼠血清，用弓形虫全虫蛋白和纯化的GST-TgSir2b蛋白作为样品，用获得的血清作为一抗进行验证。用间接ELISA法检测免疫后鼠血清抗体效价。
3.3TgSir2a和TgSir2b在速殖子增殖周期中定位的探究
利用制备的抗兔anti-TgSir2a和抗鼠anti-TgSir2b抗体作为一抗，做12h时细胞内虫体和细胞外虫体IFA实验，探究其在虫体生长发育过程中的定位。
结果：
1.BLAST比对寻找弓形虫基因组中潜在的sir2基因
查找到TgSir2序列（TGGT1_227020），碱基数为1083bp、蛋白大小为40kD，经预测有信号肽、无跨膜区域。在本研究中将其命名为TgSir2a。
查找到TgSir2-like序列（TGGT1_410770），碱基数为2832bp、蛋白大小为100kD，经预测无信号肽、无跨膜区域。在本研究中将其命名为TgSir2b。
2.检测TgSir2a和TgSir2b的去乙酰化酶活性
2.1体外表达TgSir2a蛋白
2.1.1原核表达TgSir2a蛋白
常规分子生物学方法构建pET-28b-TgSir2a△1-15aa原核表达质粒后经双酶切、测序验证成功；利用IPTG诱导后，考马斯亮蓝R-250染色实验和Western Blot实验证实重组蛋白HIS-TgSir2a△1-15aa表达成功，且蛋白表达在沉淀中；经镍柱纯化，用考马斯亮蓝法证实可得到单一的条带，说明蛋白纯化成功。
2.1.2真核表达TgSir2a蛋白
常规分子生物学方法构建pFastBac1-TgSir2a△1-15aa真核表达质粒后经双酶切、测序验证成功；收集病毒经考马斯亮蓝染色和Western Blot证实TgSir2a蛋白真核表达成功。
2.2原核表达TgSir2b蛋白
常规分子生物学方法构建pGEX-6p-1-TgSir2b原核表达质粒后经双酶切、测序验证成功；利用IPTG诱导后，考马斯亮蓝染色实验和Western Blot实验证实重组蛋白GST-TgSir2b表达成功，且蛋白表达在沉淀中；经纯化，用考马斯亮蓝法证实可得到单一的条带，说明蛋白纯化成功。
2.3TgSir2a和TgSir2b去乙酰化酶活性的检测
TgSir2a的原核表达蛋白和真核表达蛋白均具有组蛋白去乙酰化酶活性，且具有浓度依赖性，同时两者的酶活性差不多大；此外，TgSir2b原核表达蛋白同样具有组蛋白去乙酰化酶活性，且有浓度依赖性。经比较，TgSir2b酶活性显著高于TgSir2a。
3.探究TgSir2a和TgSir2b蛋白在虫体生长发育过程中的定位
3.1兔抗TgSir2a多克隆抗体的制备
Western blot和ELISA证实兔抗TgSir2a、鼠抗TgSir2b多克隆抗体制备成功且两个抗体效价均达到了1:64000。
3.2TgSir2a和TgSir2b在虫体中的定位
IFA实验证实，当虫体处于细胞外环境时，两个蛋白均定位于虫体胞浆中，而当虫体处于胞内生活环境时，两个蛋白均有向虫体膜上聚集的趋势。
结论：
本研究共发现弓形虫基因组中两个潜在的TgSir2蛋白：TgSir2a与TgSir2b。为了检测TgSir2a和TgSir2b的去乙酰化酶活性，利用原核表达和杆状病毒表达系统真核表达蛋白，分别检测酶活性，得出：两个蛋白均具备组蛋白去乙酰化酶活性，其中TgSir2b的酶活性显著高于TgSir2a。为了探究两种蛋白在弓形虫速殖子生长发育过程中的定位，制备了兔抗TgSir2a多克隆抗体和鼠抗TgSir2b多克隆抗体，用此抗体对目的蛋白的定位进行了研究，可以得出：当弓形虫速殖子从胞外到胞内的生存过程中，两个蛋白均有向虫体膜上聚集的趋势。本研究为进一步阐明TgSir2在弓形虫体内的功能、并以此为靶点研发抗弓形虫药物提供了有利的理论依据和实验材料。
Sir2全称沉默信号调节因子2（Silent information regulator2），是一类高度保守的、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），属第三类HDAC家族—sirtuins家族。
Sir2蛋白最早发现于酵母细胞中，随后在多种原核、真核细胞中被证实。人体内，Sir2被命名为SIRT2。SIRT2既可定位胞浆，也可入核，对胞浆蛋白、组蛋白或转录因子进行去乙酰化修饰。然而，对于弓形虫体内是否存在Sir2蛋白以及其功能目前尚未见相关报道。因此，为了证实弓形虫体内存在Sir2蛋白、阐明其酶活性，进行了以下研究，从而为抗弓形虫药物研发提供理论基础。
目的：
1.找到弓形虫基因组中潜在的sir2基因。
2.检测TgSir2a与TgSir2b的去乙酰化酶活性。
3.探究TgSir2a与TgSir2b蛋白在虫体中的定位。
方法：
1.BLAST比对寻找弓形虫基因组中潜在的sir2基因
以酵母Sir2氨基酸序列为模板，通过Blast搜索ToxoDB数据库，利用SignalP预测信号肽，利用TMHMM-2.0预测跨膜区域，利用Clustal Omega进行序列比对。
2.检测TgSir2a和TgSir2b的去乙酰化酶活性
2.1体外表达TgSir2a蛋白
2.1.1原核表达TgSir2a蛋白
（1）重组质粒pET-28b-TgSir2a△1-15aa的构建与鉴定
提取虫体总RNA、逆转录成cDNA后，以cDNA为模板，PCR扩增TgSir2a去掉前15个氨基酸信号肽（TgSir2a△1-15aa）的编码序列，酶切、连接后构建原核表达质粒：pET-28b-TgSir2a△1-15aa。质粒经测序验证正确后进行后续实验。
（2）TgSir2a蛋白诱导表达、纯化与鉴定
将测序正确的pET-28b-TgSir2a△1-15aa重组质粒经转化、诱导、超声，获得诱导后的上清和沉淀，做考马斯亮蓝法染色和Western Blot进行鉴定，将沉淀用盐酸胍过夜处理，经离心、过滤，镍柱纯化，做考染鉴定。
2.1.2真核表达TgSir2a蛋白
（1）重组质粒pFastBac1-TgSir2a△1-15aa的构建与鉴定
提取虫体总RNA、逆转录成cDNA后，以cDNA为模板，PCR扩增TgSir2a△1-15aa，酶切、连接后构建真核表达质粒：pFastBac1-TgSir2a△1-15aa。将测序正确的质粒转化DH10Bac感受态，得到重组杆状病毒Bacmid质粒，经过蓝白斑筛选，将白色菌落送公司测序验证，测序正确后进行后续实验。
（2）TgSir2a重组蛋白的大量表达与鉴定
将测序正确的TgSir2重组杆状病毒Bacmid质粒转染入Sf9细胞并于28℃培养箱中培养，将获得的蛋白进行考马斯亮蓝染色和Western Blot实验验证。
2.2原核表达TgSir2b蛋白
（1）重组质粒pGEX-6p-1-TgSir2b的构建与鉴定
提取虫体总RNA、逆转录成cDNA后，以cDNA为模板，PCR扩增TgSir2b编码序列，酶切、连接后构建原核表达质粒：pGEX-6p-1-TgSir2b。质粒经测序验证正确后进行后续实验。
（2）TgSir2b蛋白诱导表达、纯化与鉴定
将测序正确的GST-TgSir2b重组质粒经转化、诱导、超声，获得诱导后的上清和沉淀，做考马斯亮蓝法染色和Western Blot进行鉴定，将沉淀用盐酸胍过夜处理，经离心、过滤，Glutathione-SepharoseTM4B介质纯化，做考染鉴定。
2.3弓形虫去乙酰化酶TgSir2a和TgSir2b酶活性的检测
通过使用Epigenas?Universal SIRT Activity/Inhibition Assay Kit(Colormetric)试剂盒检测原核、真核表达的TgSir2a与原核表达的TgSir2b的去乙酰化酶活性。
3.探究TgSir2a和TgSir2b蛋白在速殖子增殖周期中的定位
3.1TgSir2a抗体的制备及验证
将纯化后的HIS-TgSir2a△1-15aa融合蛋白背部皮下多点注射免疫2只新西兰大白兔，共免疫3次，免疫结束后，采集兔血清，用弓形虫全虫蛋白和纯化的His-TgSir2a△1-15aa蛋白作为样品，用获得的血清作为一抗进行验证。用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测免疫后兔血清抗体效价。
3.2TgSir2b抗体的制备及验证
将制备好的TgSir2b的多肽背部皮下多点注射免疫5只BALB/c小鼠，共免疫3次，免疫结束后，采集鼠血清，用弓形虫全虫蛋白和纯化的GST-TgSir2b蛋白作为样品，用获得的血清作为一抗进行验证。用间接ELISA法检测免疫后鼠血清抗体效价。
3.3TgSir2a和TgSir2b在速殖子增殖周期中定位的探究
利用制备的抗兔anti-TgSir2a和抗鼠anti-TgSir2b抗体作为一抗，做12h时细胞内虫体和细胞外虫体IFA实验，探究其在虫体生长发育过程中的定位。
结果：
1.BLAST比对寻找弓形虫基因组中潜在的sir2基因
查找到TgSir2序列（TGGT1_227020），碱基数为1083bp、蛋白大小为40kD，经预测有信号肽、无跨膜区域。在本研究中将其命名为TgSir2a。
查找到TgSir2-like序列（TGGT1_410770），碱基数为2832bp、蛋白大小为100kD，经预测无信号肽、无跨膜区域。在本研究中将其命名为TgSir2b。
2.检测TgSir2a和TgSir2b的去乙酰化酶活性
2.1体外表达TgSir2a蛋白
2.1.1原核表达TgSir2a蛋白
常规分子生物学方法构建pET-28b-TgSir2a△1-15aa原核表达质粒后经双酶切、测序验证成功；利用IPTG诱导后，考马斯亮蓝R-250染色实验和Western Blot实验证实重组蛋白HIS-TgSir2a△1-15aa表达成功，且蛋白表达在沉淀中；经镍柱纯化，用考马斯亮蓝法证实可得到单一的条带，说明蛋白纯化成功。
2.1.2真核表达TgSir2a蛋白
常规分子生物学方法构建pFastBac1-TgSir2a△1-15aa真核表达质粒后经双酶切、测序验证成功；收集病毒经考马斯亮蓝染色和Western Blot证实TgSir2a蛋白真核表达成功。
2.2原核表达TgSir2b蛋白
常规分子生物学方法构建pGEX-6p-1-TgSir2b原核表达质粒后经双酶切、测序验证成功；利用IPTG诱导后，考马斯亮蓝染色实验和Western Blot实验证实重组蛋白GST-TgSir2b表达成功，且蛋白表达在沉淀中；经纯化，用考马斯亮蓝法证实可得到单一的条带，说明蛋白纯化成功。
2.3TgSir2a和TgSir2b去乙酰化酶活性的检测
TgSir2a的原核表达蛋白和真核表达蛋白均具有组蛋白去乙酰化酶活性，且具有浓度依赖性，同时两者的酶活性差不多大；此外，TgSir2b原核表达蛋白同样具有组蛋白去乙酰化酶活性，且有浓度依赖性。经比较，TgSir2b酶活性显著高于TgSir2a。
3.探究TgSir2a和TgSir2b蛋白在虫体生长发育过程中的定位
3.1兔抗TgSir2a多克隆抗体的制备
Western blot和ELISA证实兔抗TgSir2a、鼠抗TgSir2b多克隆抗体制备成功且两个抗体效价均达到了1:64000。
3.2TgSir2a和TgSir2b在虫体中的定位
IFA实验证实，当虫体处于细胞外环境时，两个蛋白均定位于虫体胞浆中，而当虫体处于胞内生活环境时，两个蛋白均有向虫体膜上聚集的趋势。
结论：
本研究共发现弓形虫基因组中两个潜在的TgSir2蛋白：TgSir2a与TgSir2b。为了检测TgSir2a和TgSir2b的去乙酰化酶活性，利用原核表达和杆状病毒表达系统真核表达蛋白，分别检测酶活性，得出：两个蛋白均具备组蛋白去乙酰化酶活性，其中TgSir2b的酶活性显著高于TgSir2a。为了探究两种蛋白在弓形虫速殖子生长发育过程中的定位，制备了兔抗TgSir2a多克隆抗体和鼠抗TgSir2b多克隆抗体，用此抗体对目的蛋白的定位进行了研究，可以得出：当弓形虫速殖子从胞外到胞内的生存过程中，两个蛋白均有向虫体膜上聚集的趋势。本研究为进一步阐明TgSir2在弓形虫体内的功能、并以此为靶点研发抗弓形虫药物提供了有利的理论依据和实验材料。