研究背景糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是一种由多病因所致胰岛素分泌或(和)作用缺陷引起的以慢性高血糖伴葡萄糖、脂肪及蛋白质代谢紊乱为特征的代谢性疾病。糖尿病在全球范围内严重影响人类健康,2012年国际糖尿病联盟的研究显示：全世界有3.71亿糖尿病患者,且半数死于糖尿病的患者低于60岁。流行病学研究表明：约75%糖尿病患者死于血管并发症,而冠状动脉、脑动脉及周围动脉等大血管并发症是致残、致死的主要原因。动脉粥样硬化是引起糖尿病大血管并发症最重要的病理改变,而血管内皮损伤是动脉粥样硬化的最重要发病机制,同时也是早期的病理生理改变。糖尿病状态下,高糖可诱导内皮细胞氧化应激,引起DNA损伤、有丝分裂周期紊乱、增殖减缓及细胞凋亡增加等,最终导致内皮损伤。因此减轻血管内皮损伤和改善动脉粥样硬化对糖尿病大血管病变的防治具有重要意义。既往研究证实：运动可改善动脉粥样硬化,其机制与减轻胰岛素抵抗、降低体重、改善血管内皮功能障碍及减轻动脉炎症反应有关。但以上机制并不能直接地解释运动对动脉粥样硬化的改善作用。学者们曾怀疑骨骼肌可能产生某种“肌肉因子”改善动脉粥样硬化,却一直缺乏证据。Irisin的发现为此提供了可能的线索。Irisin是一种主要由骨骼肌合成和分泌的激素,运动可增加其产生。Irisin在体内可将储存能量、导致肥胖的白色脂肪组织转变为消耗能量、减轻体重的棕色脂肪组织,即白色脂肪“棕色化”。动物研究证实:Irisin可减轻肥胖C57小鼠的胰岛素抵抗及体重。Moreno-Navarrete JM等的人体研究揭示：正常、超重及肥胖者血浆Irisin水平依次降低,与三者胰岛素敏感性正好相反。正常人与2型糖尿病患者的对比也呈上述表现。我们前期的研究表明：新诊断的2型糖尿病患者血浆Irisin浓度与血管内皮功能呈独立正相关。但目前尚无文献报道Irisin与动脉粥样硬化的关系。上述研究揭示了Irisin减轻胰岛素抵抗、降低体重及其循环水平与血管内皮功能正相关的特性,提示Irisin可能是骨骼肌产生的改善动脉粥样硬化的“肌肉因子”。因此,我们推测Irisin可能具有改善糖尿病引起的血管内皮功能障碍、动脉粥样硬化和高糖诱导的内皮细胞凋亡的作用。本研究旨在探索Irisin对糖尿病引起的血管内皮功能障碍、动脉粥样硬化和高糖诱导的内皮细胞凋亡的作用及机制。研究目的本研究旨在明确：1.Irisin对ApoE-/-糖尿病小鼠血管内皮依赖性舒张功能障碍有无保护作用；2. Irisin对ApoE-/-糖尿病小鼠动脉粥样硬化是否有改善作用；3. Irisin改善ApoE-/-糖尿病小鼠动脉粥样硬化的可能机制；4. Irisin对高糖诱导的内皮细胞凋亡有无保护作用；5. Irisin保护高糖诱导的内皮细胞凋亡的可能机制。方法一、动物实验1.建立ApoE-/-糖尿病小鼠模型及干预：SPF级4周龄雄性ApoE-/-小鼠30只,以高脂饲料饲养,随机分成2组,其中糖尿病模型组20只,空白对照组10只。糖尿病模型组以50mg/kg体重腹腔注射1%链脲佐菌素,每天1次,连续5天；空白对照组腹腔注射等量柠檬酸盐缓冲液。建模结束2天后,对两组小鼠进行经腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT),筛选糖尿病小鼠。以空腹血糖≥7.0mmol/L和葡萄糖负荷后2h血糖≥11.1mmol/L作为糖尿病成模标准,20只ApoE-/-小鼠全部建模成功。将糖尿病模型组ApoE-/-小鼠以体重和血糖匹配后随机均分至两组：Irisin组(Diabetic+irisin)(n=10)小鼠经尾静脉注射2μg Irisin,每周2次,持续12周；糖尿病对照组(Diabetic+NS) (n=10)小鼠经尾静脉注射等量生理盐水。空白对照组(Non-diabetic) (n=10)小鼠经尾静脉注射等量生理盐水。2.体重及血糖监测：每周检测小鼠体重及血糖变化。Irisin或生理盐水干预4周和12周后进行腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT),测定小鼠糖耐量变化。3.血管内皮依赖性舒张功能及相关信号分子测定：Irisin或生理盐水干预4周后,每组随机选取3只小鼠进行主动脉内皮依赖性舒张功能实验及Akt和eNOS磷酸化水平检测。4.血清代谢及炎性因子检测：Irisi干预12周后ELISA检测血清胰岛素、糖化血红蛋白(HbA1c)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、C反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)及Irisin水平。5.主动脉粥样斑块面积测定：Irisir干预12周后,油红O染色测定动脉粥样硬化斑块表面积与动脉壁表面积的百分比；HE染色测定主动脉斑块横断面积与主动脉管腔面积百分比。6.主动脉炎性浸润程度测定：免疫组织化学染色测定主动脉斑块巨噬细胞和T淋巴细胞浸润程度；RT-PCR测定主动脉壁IL-6、白细胞介素-10(IL-10)、TNF-a、细胞内粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1 (VCAM-1).单核细胞化学趋化蛋白-1 (MCP-1)等炎性因子转录水平。二、细胞实验1.人脐静脉内皮细胞培养：将冻存的HUVECs复苏后,以5×103/cm2密度用含20%FBS、50μg/ml ECGF、10μg/ml肝素及1%青/链霉素的M199培养液接种于细胞培养瓶中,置于37℃、5%CO2空气饱和湿度培养箱中培养。实验选用生长状态良好的第3～5代细胞。HUVECs在接受干预前,以含1%FBS的M199培养液培养20h同步化处理。2.细胞分组及检测：实验1,HUVECs加或不加LY294002(P13K抑制剂)、L-NAME(eNOS抑制剂)预培养30min,分成6组：①正糖组(NG,葡萄糖5.6mmol/L);②高糖组(HG,葡萄糖20mmol/L);③Irisin组(Irisin,葡萄糖20mmol/L+Irisin 100ng/ml);④LY294002组(LY,葡萄糖20mmo1/L+LY29400210μmol/L+Irisin 100ng/ml);⑤L-NAME组(L-NAME,葡萄糖20mmol/L+L-NAME 100μmol/L+Irisin 100ng/m;);⑥LY294002+L-NAME组(LY+L-NAME,葡萄糖20mmol/L+LY294002 10μmol/L+L-NAME 100μmol/L+Irisin 100ng/ml)。培养48h后,TUNEL试剂盒检测细胞凋亡,2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)探针(活性氧试剂盒)检测细胞内活性氧水平,RT-PCIR检测细胞内谷胱甘肽过氧化物酶-1(GPX-1)、过氧化氢酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)的mRNA水平,Western blot检测Akt、P-Akt、eNOS、P-eNOS水平。实验2,HUVECs以Scr-siRNA转染作对照或以eNOS-siRNA转染沉默eNOS基因后,分成4组：①正糖+Scr-siRNA组(NG+Scr-siRNA,葡萄糖5.6mmol/L);②高糖+Scr-siRNA组(HG+Scr-siRNA,葡萄糖20mmo1/L)；③高糖+Scr-siRNA +Irisin组(HG+Scr-siRNA+Irisin,葡萄糖20mmol/L,Irisin 100ng/ml);④高糖+eNOS-siRNA+Irisin组(HG+eNOS-siRNA+Irisin,葡萄糖20mmol/L+Irisin 100ng/ml)。培养48h后,Annexin V-FITC/PI试剂盒(流式细胞术)检测细胞凋亡。统计分析数据采用SPSS 19.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间多重比较用最小显著差异t(LSD-t)检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果一、Irisin改善ApoE-/-粮尿病小鼠动脉粥样硬化1.20只ApoE-/-小鼠均成功建立糖尿病模型。三组小鼠在实验结束前均无死亡现象发生。2. Irisin对ApoE-/-小鼠代谢及炎性因子水平作用Irisin干预4周和12周后,ApoE-/-糖尿病小鼠糖耐量改善明显,但空腹胰岛素水平Irisin组与糖尿病对照组并无明显差异。与空白对照组相比,干预12周后糖尿病模型组ApoE-/-小鼠体重、胰岛素显著降低,而血糖、糖化血红蛋白显著升高。与生理盐水相比,Irisin对ApoE-/-糖尿病小鼠的上述代谢无明显作用。ApoE-/-糖尿病小鼠血中TNF-α、CRP、IL-6及ox-LDL等炎性因子比非ApoE-/-糖尿病小鼠显著升高。而Irisin组小鼠炎性因子水平明显低于糖尿病对照组。3. Irisin改善ApoE-/-糖尿病小鼠主动脉血管内皮依赖性舒张功能糖尿病使ApoE-/-小鼠主动脉血管内皮依赖性舒张功能下降,而Irisin干预显著改善ApoE-/-糖尿病小鼠内皮依赖性舒张功能(P<0.05 vs. Diabetic+NS组)。各组间非内皮依赖性舒张功能无统计学差异(P>0.05)。糖尿病使小鼠主动脉壁Akt及eNOS磷酸化水平降低,Irisin干预的糖尿病小鼠则增加Akt和eNOS磷酸化水平。4. Irisin显著减小ApoE-/-糖尿病小鼠主动脉粥样斑块面积糖尿病模型ApoE-/-小鼠主动脉弓出现大量粥样硬化斑块,Irisin干预后粥样斑块减少。糖尿病使ApoE-/-小鼠主动脉粥样斑块表面积和横断面积显著增大,而Irisin于预显著减小ApoE-/-糖尿病小鼠主动脉粥样斑块面积。5. Irisin显著减轻ApoE-/-糖尿病小鼠主动脉炎性病变和炎性因子mRNA水平糖尿病使ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块巨噬细胞、T淋巴细胞浸润增加,主动脉壁IL-6、TNF-a、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1等炎性因子mRNA水平上调,而Irisin干预明显减少斑块炎性浸润,下调上述炎性因子mRNA水平。二、Irisin:通过激活PI3K-Akt-eNOS信号转导途径抗高糖诱导的HUVECs凋亡、氧化应激1. Irisir通过激活PI3K-Akt-eNOS信号转导途径抗高糖诱导的HUVECs凋亡与正糖组相比,高糖组细胞凋亡率显著增加(P<0.05). Irisin组细胞凋亡率明显低于高糖组(P<0.05)。而LY组和L-NAME组虽然也含有相同浓度的Irisin,但细胞凋亡率却显著高于Irisin组(P<0.05)。与正糖+Scr-siRNA组相比,高糖+Scr-siRNA组细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。高糖+Scr-siRNA+Irisin组细胞凋亡率明显低于高糖+Scr-siRNA组(P<0.05)。而高糖+eNOS-siRNA+Irisin组细胞凋亡率显著高于高糖+Scr-siRNA+Irisin组(P<0.05)。2. Irisin通过激活PI3K-Akt-eNOS信号转导途径抗高糖诱导的HUVECs氧化应激与正糖组相比,高糖组细胞活性氧水平显著增加(P<0.05)。Irisir组细胞活性氧水平明显低于高糖组(P<0.05)。而LY组和L-NAME组虽然也含有相同浓度的Irisin,但细胞活性氧水平却显著高于Irisin组(P<0.05)。与正糖组相比,高糖组细胞GTX-1、CAT、SOD的mRNA水平均显著降低(P<0.05)。Irisin组细胞GTX-1、CAT, SOD的mRNA水平明显低于高糖组(P<0.05)。而LY组和L-NAME组虽然也含有相同浓度的Irisin,但细胞GTX-1、CAT、SOD的mRNA水平却显著高于Irisin组(P<0.05)。与正糖组相比,高糖组P-Akt、P-eNOS水平显著降低(P<0.05),而Irisin组P-Akt、P-eNOS水平明显高于高糖组(P<0.05)。而LY组、L-NAME组及LY+L-NAME组P-Akt、P-eNOS水平较Irisin组均显著降低(P<0.05)结论Irisin可降低血中炎性因子水平,改善内皮功能障碍,激活内皮Akt-eNOS信号转导通路,减小动脉粥样硬化斑块表面积及横断面积,并可减少斑块中巨噬细胞及T淋巴细胞浸润,下调主动脉壁炎性因子转录水平,通过激活PI3K-Akt-eNOS信号转导途径抗高糖诱导的内皮细胞凋亡、氧化应激。Irisin具有改善糖尿病引起的血管内皮功能障碍、动脉粥样硬化和高糖诱导的内皮细胞凋亡的作用。Irisin可能可用于动脉粥样硬化病变的治疗。