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研究目的:CD4~+T细胞是细胞免疫应答的重要T细胞亚群,CD4+Th1和CD4+Th17细胞在机体抗衣原体感染中发挥免疫保护作用。在受到抗原刺激的情况下,活化的Th1和Th17通过分泌IFN-γ和IL-17发挥免疫调节作用。有研究报道,PI3K/AKT信号通路在一些病原微生物感染引起的免疫应答中会受到一些细胞因子的活化和调控从而参与调控宿主细胞的凋亡。本研究旨在探讨沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)小鼠呼吸道感染诱导的CD4~+T细胞凋亡以及PI3K/AKT信号通路相关的凋亡蛋白变化,从而有助于进一步明确衣原体感染宿主诱导主要免疫应答的进程,为应对病原微生物感染诱导的免疫细胞凋亡及治疗衣原体感染引发的相关疾病提供理论依据和帮助。研究方法:以6-8周龄雌性野生型C57BL/6小鼠为研究对象,通过鼻腔吸入1×10~3IFU(包涵体形成单位)衣原体的方式感染小鼠沙眼衣原体肺炎菌株(Chlamy muridarum,Cm),构建小鼠沙眼衣原体肺炎疾病模型。于感染后每天监测小鼠的体重和生长活动情况,分别于感染的不同时间点处死小鼠,获取小鼠肺组织,制备肺组织单个核细胞悬液。利用Trizol试剂盒提取小鼠肺组织中总RNA,RT-PCR技术检测肺组织中PI3K催化亚基p110δ的mRNA的表达水平;用蛋白裂解液提取感染后不同时间点小鼠肺组织单个核细胞中蛋白,制胶,使用Western-Blot技术检测不同感染天数小鼠肺细胞中p-AKT,Bcl-2,Bax的蛋白表达水平,以明确p-AKT的表达和Bcl-2/Bax蛋白含量随感染时间的变化趋势;使用PECY7anti-mouseCD3、APCanti-mouseCD4对小鼠肺组织单个核细胞进行表面染色,并利用Annexin、PI进行细胞凋亡染色,利用流式细胞术检测不同感染天数小鼠肺组织中CD4~+T细胞的凋亡情况,探究CD4~+T细胞凋亡在沙眼衣原体呼吸道感染过程时随时间变化趋势。实验结果:经鼻腔吸入一定剂量Cm诱导小鼠沙眼衣原体肺炎。首先对调节CD4~+T细胞凋亡的关键因子PI3K催化亚基p110δ进行了研究。Cm呼吸道感染诱导PI3K催化亚基p110δ在小鼠肺组织中高表达,RT-PCR结果显示,与未感染组相比,感染第3天,肺组织p110δmRNA表达显著增加(p<0.01),在感染第7天达到高峰(p<0.001),但在第14天下降;进一步对p-AKT和PI3K\AKT途径的下游因子抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达随感染时间的变化趋势进行研究;Western-Blot结果显示,Cm感染小鼠后第3天p-AKT蛋白的表达显著增加(p<0.01),于第7天达到最高峰(p<0.001),同样在第14天下降,其变化趋势与PI3K催化亚基p110δ的mRNA在感染前后表达水平一致。在感染后不同时间点给予PI3K抑制剂LY294002后,p-AKT受到抑制;此外,我们的结果还证实,抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax作为PI3K\AKT途径的下游因子,在调节CD4~+T凋亡的过程中发挥调节作用。与未感染组相比,Bcl-2在感染第3天增高(p<0.001),第7天达到高峰(p<0.001),第14天表达下降(p<0.01)。Bax也有相同的变化趋势,在感染后第3天表达增高(p<0.05),同样于第7天达到高峰(p<0.001),第14天下降。流式细胞仪检测肺CD4~+T细胞的早期凋亡,于感染第3天早期凋亡和细胞总凋亡均开始增高(p<0.05),于感染第7天达到高峰(p<0.001),第14天凋亡表达降低(p<0.01),但与未感染组相比,CD4~+T细胞凋亡水平仍较高。并且Bcl-2/Bax比值依感染时间降低,结果提示,抗凋亡作用逐渐降低,与流式凋亡检测的结果一致。结论:Cm呼吸道感染诱导PI3K催化亚基p110δ在感染肺组织高表达以及PI3K/AKT信号通路活化,p-AKT蛋白的表达水平与PI3K p110δmRNA表达趋势一致,提示AKT通过依赖和非依赖PI3K的方式参与Cm感染小鼠肺组织CD4~+T细胞凋亡。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是PI3K/AKT信号通路的下游因子,在维持CD4~+T细胞凋亡和生存中发挥重要作用。小鼠呼吸道感染Cm诱导凋亡蛋白和Bcl-2和Bax高表达,Bcl-2和Bax比值依感染时间降低。以上结果证实,Cm呼吸道感染诱导PI3K/AKT信号通路活化,在相关信号因子调节下抗凋亡作用逐渐降低,细胞凋亡逐渐增加,导致感染部位CD4~+T细胞发生凋亡。即沙眼衣原体呼吸道感染诱导PI3K/AKTBcl-2/Bax通路活化促进CD4~+T细胞凋亡。