论文部分内容阅读
研究背景家族性肾性糖尿主要表现为血糖正常,而尿糖阳性,是编码肾脏近端小管刷状缘钠葡萄糖共转运子 2（sodium glucose cotransporter 2,SGLT2）的 SLC5A2 基因突变所致。近年来,SGLT2抑制剂作为新型降糖药,因其长期肾脏和心脏保护作用广受关注。但其先天异常所致的肾性糖尿,作为重要的肾小管转运蛋白缺陷疾病,并未受到足够的重视,国内外报告的病例数均有限,缺乏定量的体内功能试验,对其调节基因、及与近端小管其他物质转运关系的研究也较少。研究目的1.建立家族性肾性糖尿的基因诊断方法,包括体外功能试验用于验证新变异的致病性;建立遗传性肾小管转运子异常疾病筛查的高通量测序方案Tubule Panel,筛查其它肾性糖尿相关基因及可能的遗传学关联;2.通过肾糖阈值测定,定量评估肾性糖尿严重程度;3.在基因确诊的患者中,评估肾小管其他物质转运功能,为探讨不同转运子之间可能的相互作用提供线索。研究方法1.家族性肾性糖尿基因诊断方法的建立和体外验证:对临床怀疑家族性肾性糖尿的患者,外周血提取DNA,对SLC5A2基因14个外显子进行PCR扩增后测序,与GenBank中标准序列进行比对。参考文献,设计并定制遗传性肾小管转运子疾病筛查的高通量测序方案Tubule Panel（Thermo Fisher Scientific公司）。将候选患者的基因组DNA,通过多重PCR扩增建立文库,经过乳化PCR将文库连接至Ion微球颗粒制备模板,使用测序仪（PGM）测序,根据测得变异的频率、位置和变异类型进行筛选,通过一代测序验证,确定候选基因。SLC5A2基因新突变位点体外功能验证:将野生型SLC5A2编码序列插入pEGFP-N1质粒和pEGFP-C1质粒,通过定点突变获得突变型质粒。通过脂质体转染至HEK-293T细胞中。使用共聚焦显微镜观察SGLT2-EGFP融合蛋白在细胞内的定位,明确SGLT2是否表达及表达位置。保留SLC5A2编码序列终止密码子,插入pEGFP-N1质粒,在HEK-293T细胞中表达野生型和突变型SGLT2蛋白,使用流式细胞仪检测细胞对带有荧光基团的葡萄糖类似物（2-NBDG）的摄取效率,评价突变是否影响蛋白的转运功能。2.建立口服葡萄糖测定肾糖阈的方法:患者空腹口服无水葡萄糖75g,测定服糖前（0h）、服糖后0.5h、1、1.5h、2h、3h和4h的血糖值及4h内尿糖排出总量,编程通过三次样条插值拟合血糖随时间变化曲线,通过数值逼近方法估算肾糖阈值,定量评估肾脏对葡萄糖重吸收功能。3.评价确诊患者近端肾小管转运其他物质功能:取血、尿标本,计算尿酸排泄分数及24h尿酸排泄量;行磷廓清试验,测定肾小管对磷重吸收率和磷廓清指数;进行尿氨基酸定性检测。研究结果1.家族性肾性糖尿基因诊断方法的建立和体外验证:共收集10个家族性肾性糖尿家系,共测得SLC5A2基因13种变异,其中有7种新变异（3种错义变异A212S、G484D、R564W,1 种无义变异 W649X,1 种移码变异 p.Ser592CysfsTer6,1种剪接位点变异c.574+lG>C,1个内含子变异c.469-124469-107del）。成功建立了遗传性肾小管转运子异常疾病高通量测序Tubule Panel。并在本组患者中,观察到编码MAP17蛋白的PDZK1IP1存在新变异p.Asn26ThrfsTer39;2.SGLT2体外功能试验验证:成功建立了 HEK-293T细胞体外表达SGLT2体系。观察到三种错义变异的SGLT2-EGFP融合蛋白在细胞内定位。与野生型SGLT2类似,A212S突变型所编码的SGLT2在细胞膜上呈点状分布;而G484D、R564W没有在细胞膜表达。流式细胞术观察到错义变异及无义变异（A212S、G484D、R564W、W649X）突变型编码的SGLT2蛋白,转运荧光葡萄糖类似物2-NBDG的功能均显著下降（分别为野生型的15.4%,19.3%,19.5%,21.5%）。3.口服葡萄糖测定肾糖阈值方法的建立:成功建立了口服葡萄糖测定肾糖阈值的计算工具,测得4位确诊的家族性肾性糖尿患者肾糖阈（分别为0.7、2.4、6.2和9.1mmol/L）。2位患者（2/4）的肾小管磷重吸收率和1位患者（1/4）的磷廓清指数超过正常上限;10位患者中9位接受了尿氨基酸定性检查,其中有1位尿氨基酸定性弱阳性,1位可疑阳性。尿酸排泄分数、24h尿酸排泄量（n=4）与健康受试者（n=22）无显著差异。小结:本实验条件下1.建立了家族性肾性糖尿的基因及临床诊断方法。观察到SLC5A2的7种新变异,并通过体外功能试验确认了其中错义变异和无义变异的致病性。2.建立了遗传性肾小管转运子异常疾病高通量测序Tubule Panel,观察到编码MAP17蛋白的PDZK1IP1存在新变异;3.建立了口服葡萄糖测定肾糖阈的方法,观察到部分家族性肾性糖尿患者SLC5A2突变可能同时存在近端小管对磷和氨基酸的转运异常。