据不完全统计,我国每年新增癌症病人160万。据WHO预测,到2020年世界癌症患者将增加到1470万人。因此,恶性肿瘤仍是本世纪严重危害人类健康的主要疾病之一。其中,肝癌是恶性程度很高的消化系肿瘤之一,在全世界范围内每年发病人数62.6万,发病率在全部恶性肿瘤中位居第六；每年死亡人数58.9万,致死率仅次于肺癌和胃癌位列全部癌症的第三位,且病死率呈逐年升高的趋势。目前,肝癌的治疗方法主要以手术、放疗和化疗为主,但这些方法大都毒副作用较大,很多患者最终不是死于癌症本身而是死于放化疗产生的毒副作用。因此,新型高效低毒抗癌药物的研制开发已经成为优化肿瘤治疗策略以及最终攻克癌症的希望所在。莱菔硫烷(sulforaphane, SFN)是天然存在于十字花科植物中含有的一种异硫氰酸盐(isothiocyanates, ITCs)类物质,是十字花科植物中的硫代葡萄糖苷的酶解产物,在绿花椰菜中含量最高。大量研究表明,异硫氰酸盐可选择性地抑制Ⅰ相酶的活性,诱导Ⅱ相酶的活性,降低致癌物的活化,保护机体少受甚至不受损伤,显示出很强的化学预防作用。目前认为,SFN不仅在肿瘤发生的多个阶段发挥抑癌作用,而且它还是潜在的肿瘤治疗药物。SFN与肿瘤的关系研究正成为抗肿瘤药物研究领域的热点。虽然关于肿瘤发病机制的学说很多,但总而言之,肿瘤是一类细胞周期紊乱和凋亡异常性疾病。以调控细胞周期和诱导细胞凋亡为靶点,寻找相关药物用于恶性肿瘤的治疗为抗肿瘤药物的研究提供了新的思路。本论文前期研究发现,绿花椰菜中的ITCs能够诱导人肝癌细胞系HepG-2细胞发生凋亡,进一步研究发现SFN是其中含量最高、活性最强的抗肝癌细胞活性成分。因此,本论文在前期工作的基础上,以人肝癌HepG-2细胞为对象,从细胞周期调控和诱导凋亡入手,系统研究SFN的抗肿瘤作用机制,为今后SFN作为抗肝癌药物的开发提供科学依据。1莱菔硫烷抑制人肝癌HepG-2细胞增殖和诱导凋亡作用的研究1.1莱菔硫烷对人肝癌细胞HepG-2增殖抑制作用研究目的：研究SFN对人肝癌HepG-2细胞增殖的抑制作用。方法：采用MTT比色法和SRB法测定SFN对人肝癌HepG-2细胞增殖的抑制率,计算SFN对人肝癌HepG-2细胞的IC50和GI50；采用倒置显微镜观察细胞生长状态。结果：MTT法测定结果表明,不同浓度的SFN(5、10、20、40、80μmol/L)作用于HepG-2细胞24、48、72 h均可显著抑制细胞增殖(P<0.05或P<0.01),并呈一定的时间和剂量依赖性。经计算,SFN对HepG-2细胞24,48和72 h的IC50分别为32.03μmol/L±0.96μmol/L,20.90μmol/L±1.96μmol/L和13.87μmol/L±0.44μmol/L。SRB法测定结果表明,SFN作用于HepG-2细胞48h的IC50为21.80μmol/L,GI50为19.40μmol/L,与MTT结果相印证。倒置相差显微镜下观察到对照组细胞贴壁生长,细胞饱满,边缘清晰；而SFN作用后,贴壁细胞减少,细胞均逐渐变圆,体积变小,折光性减弱。结论：SFN对人肝癌HepG-2细胞的增殖具有较强的抑制作用。1.2莱菔硫烷对人肝癌HepG-2细胞周期影响的研究目的：研究SFN对人肝癌HepG-2细胞周期阻滞作用。方法：采用PI单染法,应用流式细胞仪分析SFN作用于人肝癌HepG-2细胞后细胞周期的分布变化。结果：10、20、40μmol/L的SFN作用HepG-2细胞48h后,各组G2/M期的细胞比例显著升高,且G2/M期细胞百分比随着药物浓度增加而增大,同时G1期细胞明显减少。SFN浓度达到40μmol/L时出现凋亡峰。结论：SFN可诱导人肝癌HepG-2细胞发生G2/M期阻滞。1.3莱菔硫烷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡作用的研究目的：研究SFN对人肝癌HepG-2细胞凋亡诱导作用。方法：采用一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒原位检测DNA片段化情况；采用Annexin V-FITC/PI双染,激光共聚焦显微镜观察细胞的早期凋亡情况；透射电镜观察肿瘤细胞超微结构变化；采用流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI双染法)测定细胞凋亡率。结果：TUNEL法检测结果表明,SFN作用48h后,激光共聚焦显微镜下早期凋亡细胞核显绿色荧光。随着SFN剂量的增加凋亡细胞数量逐渐增多,而空白对照组细胞无明显着色。激光共聚焦显微镜下可见早期凋亡细胞的细胞膜被染成绿色,细胞核无明显着色。细胞膜被染成绿色,细胞核被染成红色是晚期凋亡细胞或坏死细胞。随着剂量的增加,镜下凋亡细胞数量也逐渐增加。电子显微镜下可见对照组细胞的细胞结构清晰,细胞器结构完整,核内染色质分布均匀,线粒体结构正常,细胞表面有微绒毛突起。而SFN作用后,细胞出现典型的凋亡形态,如微绒毛减少,细胞核内染色质固缩、凝集于核膜边界,形成新月状小体,核周间隙扩张,线粒体肿胀,胞浆空泡化,细胞形成凋亡小体。流式细胞仪检测结果表明,10、20、40μmol/L的SFN作用于HepG-2细胞48h后,早期凋亡细胞百分率分别达到27.42%±0.43%、46.53%±0.35%和58.92%±0.48%,与对照组1.6%±0.06%比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论：SFN可诱导人肝癌HepG-2细胞发生凋亡。2莱菔硫烷诱导人肝癌HepG-2细胞G2/M期阻滞及凋亡的机制研究2.1莱菔硫烷诱导人肝癌HepG-2细胞G2/M期阻滞的机制研究目的：研究SFN诱导人肝癌HepG-2细胞G2/M期阻滞的分子作用机制。方法：采用Western Blot法检测SFN对人肝癌HepG-2细胞内CdKl,p-CdKl(Thr14), cyclinB1,Cdc25C,p21等G2/M期相关蛋白表达的影响。结果：10、20、40μmol/L的SFN作用HepG-2细胞48 h后,均可显著下调CdKl, cyclinB1, Cdc25C蛋白表达水平,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01),同时显著上调p-CdKl(Thr14)和p21蛋白表达水平,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论：SFN可通过降低CdK1-cyclinB1复合物的形成,同时通过下调Cdc25C表达、上调p21表达来抑制CdK1或CdKl-cyclinBl复合物的活性,诱导HepG-2细胞发生G2/M期阻滞。2.2莱菔硫烷通过线粒体途径诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的机制研究目的：研究SFN诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的分子作用机制。方法：采用酶活力检测试剂盒测定SFN对人肝癌HepG-2细胞Caspase-3,-8,-9活性的影响,采用激光共聚扫描焦显微镜测定细胞内线粒体膜电位(Δψm)和钙离子浓度,采用流式细胞仪测定人肝癌HepG-2细胞内ROS含量；采用Western blot法测定SFN对HepG-2细胞内Cyt-c蛋白表达的影响：采用Western blot法和RT-PCR法测定SFN对HepG-2细胞内Bcl-2、Bax表达的影响。结果：不同浓度的SFN作用于HepG-2细胞48h后,细胞线粒体膜电位Δψm随着SFN浓度的升高而逐渐降低,呈一定的剂量依赖关系；20、40μmol/L组FI值与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。细胞内钙离子浓度随着SFN浓度的升高而逐渐升高。10、20、40μmol/L SFN剂量组细胞内[Ca2+]i(FI)分别为45.68±10.51、88.62±16.09和176.33±25.14,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。同时,细胞内活性氧水平显著升高,分别为28.74±4.59、52.90±6.61和90.32±5.95,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR法和Western blot法检测结果表明,SFN能下调HepG-2细胞中Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平,同时上调Bax mRNA和蛋白表达水平,且Bcl-2/Bax和Bcl-2mRNA/Bax mRNA随剂量的增加而降低,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。此外,SFN可上调细胞内Cyt-c蛋白表达量,并呈一定的剂量依赖性,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。试剂盒检测结构表明,SFN可升高细胞内Caspase-3,-8,-9活性,并呈一定的剂量依赖性,各剂量组与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论：SFN可能是通过下调Bcl-2基因表达、上调Bax基因表达,进而诱导线粒体通透性转变孔道(PT孔道)的开放,促进线粒体内Cyt-c向胞浆的释放。释放的Cyt-c可能进一步与Apaf-1、procaspase-9结合形成凋亡体,活化的caspase-9进一步激活下游的caspase-3,最终完成SFN通过线粒体途径诱导HepG-2细胞的凋亡过程。2.3莱菔硫烷通过MAPK信号转导途径诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡机制研究目的：阐明MAPK信号传导通路在SFN诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡中的作用。方法：采用Western blot法研究SFN对人肝癌HepG-2细胞中MAPK信号通路相关蛋白P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK/SAPK和p-JNK/SAPK蛋白表达的影响。结果：10、20、40μmol/L的SFN作用人肝癌HepG-2细胞48h后,随着药物浓度的增加,p-P38和p-JNK蛋白表达量逐渐增加,而p-ERK的表达量逐渐降低,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。同时,P38、ERK和JNK蛋白相对表达量与对照组相比并无显著性差异(P>0.05)。结论：MAPK信号转导途径在SFN诱导人肝癌HepG-2细胞周期阻滞和凋亡过程中发挥重要作用,SFN可通过启动MAPK信号通路诱导人肝癌HepG-2细胞G2/M期阻滞进而引起细胞凋亡。结论SFN对人肝癌HepG-2细胞具有显著地抗肿瘤作用,其可能的作用机制如下：①SFN可通过降低CdK1-cyclinB1复合物的形成,同时通过下调Cdc25C表达、上调p21表达来抑制CdK1或CdK1-cyclinB1复合物的活性,诱导HepG-2细胞发生G2/M期阻滞；②SFN可通过下调Bcl-2基因表达、上调Bax基因表达,进而诱导线粒体通透性转变孔道(PT孔道)的开放,促进线粒体内Cyt-c向胞浆的释放,进而激活caspase-9和下游的caspase-3,最终通过线粒体途径诱导HepG-2细胞发生凋亡；③SFN可通过激活p38MAPK信号转导通路,作用于Cdc25C磷酸酶而使其失活,导致其无法激活Cdk1而将细胞阻滞于G2/M期；同时,通过促进fas/fasL介导的细胞凋亡途径激活Caspase-8,启动Caspase级联反应而诱导HepG-2细胞凋亡,但这一推测仍有待研究证实；④SFN可通过下调p-ERK的表达抑制ERK通路的激活,进而抑制Bcl-2所致的抗凋亡作用,促进细胞凋亡；⑤SFN可通过促进JNK的磷酸化促进线粒体介导的细胞凋亡；同时,激活Fas/FasL介导的细胞凋亡途径而激活Caspase-8,最终激活Caspase-3诱导细胞凋亡；活化的JNK/SAPKs还可通过翻译后的磷酸化修饰稳定p21的活性,进而抑制Cdkl的活化,诱导细胞发生G2/M期阻滞。本研究的创新点1.首次研究发现启动G2/M期DNA损伤检查点调节机制是SFN诱导人肝癌HepG-2细胞周期阻滞的主要分子机制。2.首次研究发现线粒体介导的凋亡通路是SFN诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的主要途径,下调Bcl-2基因表达、上调Bax基因表达是SFN启动内源性凋亡通路的关键。3.首次研究发现MAPK信号通路是SFN诱导人肝癌HepG-2细胞G2/M期阻滞和凋亡的关键调节通路和重要作用靶点。