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老年性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是与年龄相关的黄斑部退行性眼病,是眼科常见的致盲眼病之一,多见于50岁以上的中老年人,严重影响患者的生活质量。本病主要分为干性和湿性两种,病变部位主要为视网膜色素上皮-Bruch膜-脉络膜毛细血管层复合体,其中视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)功能障碍是本病的关键因素。本病病因尚不明确,但众多研究显示由氧自由基(reactive oxygen species,ROS)介导的视网膜色素上皮氧化应激损伤在AMD发病过程中起着重要作用。补肾养血明目方是导师庄曾渊研究员临床经验的总结,临床常用于治疗视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)、干性AMD等RPE退行性疾病,补肾养血明目方由枸杞子、当归、仙灵脾、远志组成,前期研究证明补肾养血明目方可以延缓rds小鼠视网膜色素变性过程中感光细胞凋亡的发展,提高视网膜线粒体膜电位,降低体外培养ARPE-19细胞内Ca2+浓度,抵抗谷氨酸损伤后引起的细胞内Ca2+升高。干性AMD与RP同为退行性眼病,发病部位类同,中医补益肝肾、养血明目异病同治有一定的疗效,为进一步研究补肾养血明目方的作用,本研究旨在探讨补肾养血明目方保护RPE细胞氧化应激损伤的作用及作用机制,为临床治疗RPE变性及营养障碍类眼底病提供新的研究思路。目的在前期研究证明补肾养血明目方能够延缓rds小鼠视网膜色素变性过程中感光细胞凋亡的基础上,通过体内及体外实验研究,观察补肾养血明目方对视网膜色素上皮细胞凋亡的影响,探讨补肾养血明目方抗RPE氧化应激的作用机制。方法1体外研究,运用血清药理学方法制备补肾养血明目方含药血清,以75μmol/L丙烯醛诱导建立ARPE-19细胞氧化应激模型,分为正常组、模型组、模型+空白血清组、模型+低剂量药物血清组、模型+中剂量药物血清组和模型+高剂量药物血清组,采用细胞增殖-细胞毒性检测(CCK-8)和原位末端转移酶标记(TUNEL)的方法,观察补肾养血明目方(枸杞子、当归、仙灵脾、远志)对ARPE-19细胞活性、细胞形态及细胞凋亡率的影响。2体内研究,碘酸钠腹腔注射建立C57小鼠氧化应激模型,以补肾养血明目方为处理因素,叶黄素片为阳性对照,另设模型组与正常组,采用电生理学、组织病理学、脉络膜铺片、TUNEL、免疫荧光技术及化学比色法等研究手段。观察补肾养血明目方作用后小鼠视网膜电生理活动、视网膜组织结构、感光细胞凋亡及血清氧化酶含量等的变化。结果1.补肾养血明目方对体外培养ARPE-19细胞氧化应激损伤的干预研究:本研究发现补肾养血明目方对ARPE-19细胞活性有影响:(1)CCK-8法检测发现根据补肾养血明目方含药血清浓度不同,对ARPE-19细胞干预作用不同,其中2.5%及5%补肾养血明目方含药血清预培养24h对ARPE-19细胞较空白血清组有一定的保护作用(P<0.05);(2)补肾养血明目方含药血清能够降低ARPE-19细胞的凋亡率。2.补肾养血明目方对碘酸钠诱导小鼠视网膜变性模型的干预作用研究:(1)通过闪光视网膜电图发现补肾养血明目方能够提高视网膜感光细胞的电活动,较叶黄素组有统计学意义(P<0.05);(2)HE染色发现补肾养血明目方组小鼠视网膜颗粒层细胞排列较模型组及叶黄素组整齐,造模后28天各组视网膜外颗粒层明显变薄,补肾养血明目方组保留较薄的一层外颗粒层,模型组及叶黄素组外颗粒层几乎消失;通过感光细胞核计数造模后14天中药组内颗粒层细胞数为13.53±1.50,与对照组11.00±1.12相比于统计学有意义(P<0.05),造模后28天补肾养血明目方组内外颗粒层细胞数14.28±1.73、6.40±2.02,较模型组11.23±1.15、3.57±2.02及叶黄素组11.02±0.41、3.86±2.44均有统计学意义(P<0.05);(3)脉络膜铺片染色可见造模后28天补肾养血明目方组较模型组及叶黄素组RPE细胞核排列整齐,形态较规则;(4)8-OhdG免疫荧光双染法可见7天时各组RPE细胞均可见少量表达,14天及28天时补肾养血明目方组阳性表达较模型组及叶黄素组明现变弱;(5)通过化学比色法研究发现,造模后7天、14天、28天补肾养血明目组小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性 261.90±42.42 U/mml、226.65±97.79 U/ml、316.67±12.80 U/ml 高于模型组141.87±81.83 U/ml、112.49±76.98 U/ml、273.32±50.85 U/ml,7天及28天谷胱甘肽过氧化物酶活性(GSH-Px)活性452.30±153.42 U/ml、483.67±23.37 U/ml 高于模型组 278.99±129.06 U/ml、343.15±118.76 U/ml,有统计学意义(P<0.05)。结论补肾养血明目方能够降低RPE细胞氧化损伤、提高血清抗氧化酶SOD及GSH-Px活性,提示应用补肾养血明目药物干预可减轻由RPE氧化损伤引起的退行性眼病的病变程度。