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研究背景胰腺癌是恶性程度最高的消化道肿瘤之一,患者整体五年生存率仅为11%。胰腺癌早期症状不典型,且进展极快,大多数患者在确诊时已经处于进展期而失去了手术机会。胰腺癌化疗敏感性差,对靶向治疗和免疫治疗不敏感。因此,深入探究胰腺癌耐药的机制,寻找治疗靶点,对于改善胰腺癌患者的预后具有重要意义。BET家族蛋白是重要的表观遗传调节蛋白和转录调控蛋白,对于细胞正常生长、细胞周期的进行具有重要意义。JQ1是最早发现的BET家族蛋白抑制剂,通过抑制BRD4等蛋白的功能,抑制原癌基因的转录,在多种肿瘤中发挥抑癌的作用。本研究前期通过细胞和动物实验,发现胰腺癌细胞对于JQ1的敏感性存在很强的异质性,而JQ1敏感的细胞在JQ1处理后出现METTL3蛋白水平和m~6A甲基化水平的下降。N~6-甲基腺嘌呤（N~6-methyladenosine,m~6A）是真核生物mRNA上含量最丰富的可逆性化学修饰之一,参与mRNA剪接、出核、降解以及翻译等重要过程,从而影响基因的表达并在多种生理和病理过程中发挥重要的作用,影响恶性肿瘤的发生和发展。目前对于m~6A在胰腺癌发生发展过程中发挥的作用以及在胰腺癌治疗中的意义的相关研究仍处于初级阶段,需进一步深入探索。METTL3作为m~6A写入酶介导RNA甲基化过程,多项研究表明METTL3在多种肿瘤中高表达并促进肿瘤的发展和侵袭。近年来,很多研究探讨了小分子化合物或代谢产物对m~6A修饰水平的影响,但对于靶向于染色质修饰的药物JQ1能否影响肿瘤中METTL3的表达和功能以及m~6A的修饰水平,目前没有明确的结论。同时,对于METTL3是否参与胰腺癌的JQ1敏感性调控以及相关分子机制有待明确。解析METTL3-m~6A相关通路在JQ1抑制胰腺癌的过程中发挥的作用以及探索联合抑制BET蛋白和METTL3在胰腺癌中的作用和机制可以在临床中为患者的治疗提供新的思路。研究目的解析METTL3-m~6A相关通路在JQ1抑制胰腺癌的过程中的作用以及联合抑制BET蛋白和METTL3在胰腺癌中的作用和机制,为指导胰腺癌的临床治疗提供新的思路和方向,帮助改善胰腺癌患者的整体生存和预后。研究方法首先,通过SRB方法对不同胰腺癌细胞系对JQ1的敏感性进行检测,并通过克隆形成实验,细胞增殖实验以及裸鼠皮下成瘤实验筛选敏感和耐受细胞系以备进一步的研究。通过质谱检测、Western blot、qPCR方法,探索JQ1处理后,m~6A及m~6A相关修饰酶的变化情况。在胰腺癌细胞系中,过表达或敲METTL3蛋白,通过SRB方法对细胞的增殖能力以及JQ1敏感性进行评估。构建强力霉素诱导的METTL3敲低稳转细胞株,通过克隆形成实验和裸鼠皮下移植瘤实验,验证METTL3敲低对JQ1敏感性的影响。同时,使用Combenefit软件,计算目前已有的METTL3抑制剂STM2457和UZH1a与JQ1的联合效应。此外,使用JQ1敏感细胞系MIA-PaCa2构建JQ1耐药的MIA-PaCa2-JR,验证METTL3敲低对MIA-PaCa2-JR的JQ1敏感性的影响。最后,通过MeRIP-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、多聚核糖体分析实验、Western blot和qPCR等实验方法,探索JQ1-m~6A通路的下游靶点以及联合抑制BET蛋白和METTL3在胰腺癌治疗中的作用和机制。研究结果首先,细胞和动物实验表明,不同的胰腺癌细胞系对于JQ1的敏感性存在很强的异质性。其中MIA-PaCa2、HPAF-Ⅱ以及BxPC3对于JQ1有着较高的敏感性。JQ1敏感的胰腺癌细胞系在JQ1处理后出现METTL3蛋白水平和m~6A水平的下降。细胞实验证明,敲低METTL3可以抑制胰腺癌细胞系的增殖能力。临床样本检测和公共数据库分析结果显示,METTL3高表达与较差的患者预后相关。MeRIP-seq结果显示,在胰腺癌细胞系中敲低METTL3影响多条与细胞增殖和细胞周期相关的重要通路。进一步的MeRIP-seq结果表明,JQ1的传统功能的实现部分依赖于m~6A。通过MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、Western blot和多聚核糖体分析实验,我们发现在MIA-PaCa2细胞中JQ1可以通过m~6A-YTHDF1途径影响SP1 mRNA的翻译水平,从而影响SP1的表达。细胞增殖实验、公共数据库分析和拯救实验的结果表明,SP1在胰腺癌细胞中发挥促进肿瘤的作用并且能够逆转JQ1处理导致的增殖水平下降。最后,体内和体外实验结果均表明在JQ1耐受细胞系中靶向METTL3可以提高细胞对于JQ1的敏感性。在机制方面,通过MeRIP-seq、MeRIP-qPCR、Western blot和EU-labeling-qPCR等实验方法发现,METTL3敲低和JQ1处理可以共同降低E2F8的m~6A修饰水平,降低E2F8基因的转录从而影响基因的表达。同时也发现了 JQ1-METTL3通过m~6A依赖的途径调控lncRNA PVT1的表达从而影响MYC基因的RNA和蛋白表达的可能机制。重要的是,我们发现目前正准备进行临床实验的METTL3抑制剂STM2457以及另一种METTL3抑制剂UZH1a均可以在JQ1耐受的细胞系中与JQ1发挥联合治疗作用。结论综上所述,本研究首次解析了 m~6A及其甲基化酶METTL3在胰腺癌JQ1治疗中的作用以及联合抑制BET蛋白和METTL3在胰腺癌中的治疗效果和机制,为胰腺癌患者的临床治疗提供了新的思路和联合治疗的靶点。