背景和目的:肺癌(Lung Cancer,LC)在所有恶性肿瘤相关死亡原因中位居首位。小细胞肺癌(SCLC)是肺癌中预后最差的类型,在LC中占14-20%的比例。其生长速度快,转移早,预后差。即使经历正规放化疗,SCLC患者中位生存期仅为8-13个月。顺铂耐药导致的治疗效果不佳是SCLC患者生存率不高的重要原因。因此,积极探讨SCLC耐药的具体机制对改善SCLC预后具有重要的指导意义。顺铂(CDDP),为一种最常用的细胞毒类化疗药物。绝大部分小细胞肺癌患者均采用以顺铂为基础的联合治疗方案。然而,暴露于顺铂的恶性细胞可能激活自身适应性反应来抵抗顺铂的抗增殖/细胞毒作用,并最终产生对顺铂的耐药性,使患者对以顺铂为基础的化疗反应不佳。PI3K/AKT通路是生理功能必需的信号传导通路,其信号轴可提供强大的促生存因子。因此,AKT通路可能在肿瘤顺铂靶下耐药中扮演了重要的角色。但其详细作用的机制及其在顺铂耐药中的重要程度尚不很清楚。SHP2(Src homology 2-containing protein tyrosine phosphatase 2),是一种在人体多种组织中广泛表达的非受体蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)。它在多种细胞事件过程如细胞增殖、存活、迁移中起着关键作用。对SHP2突变或异常表达与血液恶性肿瘤及多个实体瘤有关。SHP2可以以连接蛋白的功能结合PI3K的P85亚基及相关激活促进因子,导致PI3K活化。SHP2也能通过PTP催化活性依赖的方式,激活PI3K/Akt信号。但SHP2激活PI3K/Akt的效应研究主要集中在肿瘤发生、转移方面,它在肿瘤耐药中的作用还未得到充分认识。我们前期发现SHP2在化疗耐药的肺癌细胞中高表达,提示它可能参与了肺癌化疗耐药过程。CA916798是我们前期通过消减抑制杂交(SSH)在肺癌多药耐药细胞株SPC-A-1/CDDP中发现的耐药相关蛋白。其与目前已知蛋白无同源性。CA916798的结构中有多个丝/苏氨酸激酶及酪氨酸激酶激活位点,表明它可被相关激酶激活,参与信号转导过程。研究表明,CA916798对肺肿瘤细胞顺铂敏感性下降起促进作用,且可被PI3K/AKT通路调节。基于以上研究我们推测:SHP2可通过PI3K/AKT通路调节CA916798的表达,进而导致SCLC对顺铂耐药。本研究即为证实以上推测而进行。材料与方法:本研究分为体外实验、体内试验和临床检测分析三大部分。1.以顺铂敏感的亲代小细胞肺癌细胞系H446及在采用顺铂诱导亲代细胞建立的耐药细胞株H446/CDDP为研究对象2.将SHP2表达质粒转染亲代细胞H446,SHP2 Sh RNA质粒转染耐药细胞H446/CDDP,并筛选出稳定高/低表达SHP2的细胞株3.在干预SHP2的同时,转染AKT持续表达质粒或AKT RNA干扰质粒,观察在不同AKT表达水平的情况下,SHP2诱导的SCLC顺铂耐药程度是否有所改变4.采用CCK8法检测各细胞株对顺铂敏感程度5.免疫共沉淀检测与SHP2相互结合的蛋白6.Western-blotting检测各蛋白表达水平7.Real-time PCR测定相关蛋白m RNA表达量8.将上述各细胞株皮下注射入裸鼠体内,建立裸鼠移植瘤模型9.顺铂或生理盐水腹腔注射对裸鼠移植瘤进行处理,通过观察各组裸鼠移植瘤体积的变化,判断各组细胞对顺铂治疗的敏感程度10.筛选经化疗4-6周期的小细胞肺癌病人,收集数据,并取肿瘤组织进行HE及免疫组化染色,检测SHP2及CA916798蛋白表达的相关性,同时比较不同蛋白表达水平的患者在化疗后生存时间有无差异。结果:1.SHP2在SCLC顺铂耐药中的作用(1)对实验所用顺铂敏感的H446细胞及对顺铂耐药的H446/CDDP细胞进行鉴定,神经特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光显示H446及H446/CDDP均有NSE表达,证实所用细胞确为小细胞肺癌细胞系。(2)H446细胞顺铂IC50值为2.493ug/ml,H446/CDDP细胞顺铂IC50值为15.239ug/ml。H446/CDDP的耐药指数为6.1127(vs.H446)。与未经干预的H446细胞比较,H446/CDDP能耐受更高浓度的顺铂。(3)Western-blotting结果显示,与H446细胞比较,H446/CDDP中SHP2表达量明显上升(P<0.05)。(4)将SHP2表达质粒转染H446细胞并进行筛选,建立持续表达高水平量SHP2的H446-SHP2细胞株;将SHP2 Sh RNA质粒转染顺铂耐药细胞H446/CDDP并进行筛选,建立持续表达低水平量SHP2的H446/CDDP-sh SHP2细胞株。H446-SHP2与H446比较,SHP2表达量升高;H446/CDDP-sh SHP2与H446/CDDP比较,SHP2表达量降低,提示对SHP2的表达干预成功。(5)半定量测定结果表明各细胞株SHP2 m RNA表达水平与蛋白表达水平呈正相关趋势,但这种相关趋势无统计学意义(P>0.05)。(6)总磷酸酶活性检测显示:各细胞株总磷酸酶活性亦有与蛋白表达水平呈正相关趋势,但差异仍未有统计学意义。(7)H446顺铂IC50值为5.14ug/ml,H446-SHP2顺铂IC50值为10.414 ug/ml。H446-SHP2耐药指数为2.03(vs.H446)。H446/CDDP顺铂IC50值为13.351 ug/ml,H446/CDDP-sh SHP2顺铂IC50值为6.621ug/ml,H446/CDDP-sh SHP2的耐药指数为0.4959(vs.H446/CDDP)。在对顺铂敏感的H446细胞株中,高表达SHP2可使H446细胞对顺铂耐药;在对顺铂耐受的H446/CDDP细胞株中,部分抑制SHP2表达可使顺铂耐药的细胞株H446/CDDP部分恢复对顺铂的敏感性。2.SHP2促进SCLC顺铂耐药的机制(1)在H446及H446/CDDP细胞内,SHP2与PI3K p85亚基及CA916798均可结合。在总SHP2量大致相同的情况下,H446/CDDP细胞与H446细胞比较,SHP2结合的p85及CA916798的量更多。加入顺铂后与加入顺铂前比较,SHP2结合的p85及CA916798的量也有所增加。(2)H446细胞高表达SHP2后,AKT、p AKT、pm TOR及CA916798蛋白表达随之增高(P<0.05)。在顺铂耐药的H446/CDDP细胞,部分抑制SHP2蛋白表达后,下游AKT、p AKT、pm TOR、CA916798蛋白表达随之降低(P<0.05)。这提示SHP2表达量的变化可影响下游AKT通路相关蛋白的活性及CA916798表达量的变化。(3)与转入空载体比较,H446细胞在转染AKT RNA干扰质粒后,AKT蛋白表达水平下降;转染AKT表达质粒后,AKT蛋白表达水平升高。说明相关质粒可有效干预AKT的表达。(4)在高表达SHP2的H446细胞中部分抑制AKT表达,可使增高的CA916798表达量降低(P<0.05)。在低表达SHP2的H446细胞中高表达AKT可使降低的CA916798恢复到一个比较高的水平(P<0.05)。说明SHP2可通过AKT调控CA916798表达量变化。(5)H446细胞顺铂IC50值为4.82ug/ml,H446-SHP2顺铂IC50值为10.902ug/ml,H446-SHP2-si AKT顺铂IC50值为6.236ug/ml。上述结果表明:在持续表达高水平SHP2的H446-SHP2细胞中部分抑制AKT,可使耐药性增高的H446-SHP2细胞部分恢复对顺铂的敏感性。H446/CDDP顺铂IC50值为11.032ug/ml,H446/CDDP-sh SHP2顺铂IC50值为5.983ug/ml,H446/CDDP-sh SHP2-AKT顺铂IC50值为9.344ug/ml。上述结果表明:在部分抑制SHP2的H446/CDDP细胞中高表达AKT,可使本来对顺铂耐药性下降的H446/CDDP-sh SHP2细胞对顺铂的耐药性又恢复到比较高的水平。对AKT表达水平进行干预,可部分抵消SHP2表达变化对SCLC细胞顺铂耐药性的影响。3.SHP2在动物体内对SCLC顺铂耐药性的影响与生理盐水处理比较,H446组与H446/CDDP-sh SHP2组顺铂治疗后肿瘤体积均明显缩小(P<0.05),H446-SHP2组与H446/CDDP组顺铂治疗后肿瘤体积差异均不显著(P>0.05)。这从动物体内水平证实高表达SHP2可导致小细胞肺癌对顺铂敏感性下降,部分抑制SHP2可使小细胞肺癌对顺铂敏感性增加。4.临床验证SHP2和CA916798表达相关性及与化疗耐药的关系(1)共有20名肿瘤组织高表达SHP2的患者及12名肿瘤组织低表达SHP2的患者入组分析,两组在性别、年龄、初始化疗周期等方面的差异无统计学意义。20名高表达SHP2的小细胞肺癌患者的肿瘤组织中有13名同时高表达CA916798,而12名低表达SHP2的小细胞肺癌患者中仅有3名同时高表达CA916798(P<0.05)。表明人小细胞肺癌肿瘤组织SHP2与CA916798表达具有一定的相关性。(2)生存曲线分析显示,与小细胞肺癌肿瘤组织低表达SHP2患者比较,高表达SHP2的患者平均生存时间更短(P=0.045)。与肿瘤组织低表达CA916798患者比较,高表达CA916798的患者平均生存时间更短(P=0.002)。说明高表达SHP2及CA916798与患者对化疗预后不佳有关。结论:本研究提供的证据显示,SHP2可促进SCLC对顺铂耐受性增加,其机制主要是通过调节PI3K/AKT/CA916798这一信号途径来实现的。在临床小细胞肺癌患者中,肿瘤组织SHP2及CA916798表达情况可作为化疗预后相关指标。我们的研究初步阐明SHP2/PI3K/AKT/CA916798这一通路在SCLC化疗耐药中的作用及机制,为今后临床逆转SCLC顺铂耐药奠定了一定的理论基础,并提供了可供干预的靶点。