论文部分内容阅读
华北大黑鳃金龟(Holotrichia oblita Faldermann)是一种严重危害我国北方地区农作物的地下害虫。该昆虫具有分布范围广、食性杂、为害严重等特点,长期以来,使用农药等传统方法对其进行防控的效果不佳,同时造成了土壤环境破坏、天敌死亡等多种潜在威胁。因此,寻找一种对华北大黑鳃金龟的绿色高效防控手段已经迫在眉睫。近年来,越来越多的研究者从逆向化学生态学入手,通过研究昆虫对寄主植物挥发物的外周嗅觉识别机制来开发昆虫的行为调控剂。本文以华北大黑鳃金龟成虫为研究对象,首先确定其寄主植物挥发物的种类,并通过触角电位和Y管行为学实验初步筛选对华北大黑鳃金龟行为有显著吸引的化合物,为开发有效的行为调控剂提供候选化合物;随后探究气味受体(OR)和感受神经元膜蛋白(SNMP)在华北大黑鳃金龟识别功能性化合物过程中发挥的作用,从而明确华北大黑鳃金龟对功能性寄主植物挥发物的外周嗅觉感受机制,为华北大黑鳃金龟的防治和开发有效的行为调控剂具有指导意义。主要结果如下:(1)对华北大黑鳃金龟25种寄主植物的150种挥发物进行成虫触角电位反应实验,结果显示,华北大黑鳃金龟的成虫触角在化合物浓度为1μg/μL的刺激下对150种植物源挥发物反应差异很大。与溶剂石蜡油对照组相比,尤其对乙酸-顺-3-己烯酯、反式-2-己烯-1-醇、顺-3-己烯基异丁酸酯、甲基庚烯酮、苯甲醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮等6种化合物有强烈的触角电位反应。(2)Y管行为学实验测试了华北大黑鳃金龟成虫对乙酸-顺-3-己烯酯、反式-2-己烯-1-醇、顺-3-己烯基异丁酸酯这3种EAG反应排名前三的植物源挥发物的行为选择,结果显示,乙酸-顺-3-己烯酯在0.1μg/μL和1μg/μL浓度下对华北大黑鳃金龟成虫有显著的吸引作用;反式-2-己烯-1-醇、顺-3-己烯基异丁酸酯在0.1μg/μL的浓度下对华北大黑鳃金龟有显著的吸引作用。(3)根据华北大黑鳃金龟触角转录组筛选气味受体基因家族和感受神经元膜蛋白基因家族的序列,设计全长特异性引物,成功克隆出HoblOR1、HoblOR5、HoblOR6、HoblOR15、HoblORco和HoblSNMP1共6个基因的ORF全长序列,并成功将其连接到p-GEMHE表达载体当中,为后续的体外表达实验奠定了基础。(4)通过双极电压钳系统对华北大黑鳃金龟的4个嗅觉受体进行了功能研究,筛选到一种可以明显激活HoblOR15受体的配体化合物——乙酸-顺-3-己烯酯。乙酸-顺-3-己烯酯对华北大黑鳃金龟成虫具有显著性的吸引作用。乙酸-顺-3-己烯酯作为多种昆虫的性诱剂增效剂,可以提高性诱剂对昆虫的诱捕效果。(5)通过将HoblSNMP1与HoblOR15/HoblORco共同表达于非洲爪蟾卵母细胞中进行双极电压钳实验,结果表明,表达HoblSNMP1/HoblOR15/HoblORco的蛙卵与表达HoblOR15/HoblORco的蛙卵细胞相比,对乙酸顺-3-己烯酯化合物的反应更大。因此认为HoblSNMP1可以增强对HoblOR15对乙酸顺-3-己烯酯的识别作用。综上所述,本文初步筛选了对华北大黑鳃金龟成虫具有显著吸引作用的寄主植物挥发物,其中乙酸顺-3-己烯酯的吸引效果最明显,该化合物来源于华北大黑鳃金龟的多种寄主植物,如榆树,苹果等,推测该化合物可能对成虫的行为有重要的作用,随后确定了HoblOR15可以与乙酸顺-3-己烯酯特异性结合并被激活,HoblOR15参与了华北大黑鳃金龟对乙酸顺-3-己烯酯的感知过程,同时HoblSNMP1可以显著增强HoblOR15对乙酸顺-3-己烯酯的识别效果。本文完成了华北大黑鳃金龟对乙酸顺-3-己烯酯的外周嗅觉感受机制的研究,同时乙酸顺-3-己烯酯可以作为候选化合物,为今后华北大黑鳃金龟的防治和开发有效的吸引剂具有重要意义。