背景随着经济的发展和生活水平的提高,妊娠期糖尿病的发病率正在逐年上升,在发展中国家的发病率由过去20年内的2.9%上升到8.8%。大多数的妊娠期糖尿病患者于产后糖代谢异常可以恢复正常,但20%-50%将来会发展成为糖尿病,妊娠期糖尿病对母儿均造成较大的危害,在国内外产科界正受到越来越多的关注。最近,已有确凿证据表明,瘦素在绒毛滋养细胞中有着强表达,而在妊娠期糖尿病时,滋养细胞合成、分泌瘦素的水平较正常妊娠时显著增多。许多学者认为瘦素与妊娠期糖尿病的发生和发展有着密切相关。然而,瘦素究竟如何参与妊娠期糖尿病的发生与发展,目前并不完全清楚。本实验基于以往研究的基础上,采用体外培养人工流产胚胎的绒毛滋养细胞,并于培养基中加入不同浓度的瘦素,选用RT-PCR及Western blot方法测定瘦素对滋养细胞胰岛素受体、胰岛素受体底物-1的表达及其酪氨酸磷酸化的影响。着重研究瘦素对早孕绒毛滋养细胞胰岛素受体信号传导障碍的影响,为妊娠期糖尿病的预防、监测及治疗提供一定的理论依据。目的了解瘦素对滋养细胞胰岛素受体信号转导异常的影响。方法体外培养人工流产胚胎的绒毛滋养细胞,根据细胞培养基中加入瘦素浓度的不同将实验分为空白对照组以及瘦素浓度分别为100、250、500μg/L的实验组。采用RT-PCR方法测定胰岛素受体底物-1的mRNA表达,并采用Western blot方法测定胰岛素受体、胰岛素受体底物-1的蛋白表达及其酪氨酸磷酸化蛋白的表达。结果试验一结果:1.滋养细胞培养及鉴定结果:(1)形态学观察:细胞呈不规则的多角形,核大,卵圆形,细胞浆丰富透明。(2)免疫组化鉴定结果:滋养细胞的波形蛋白染色阴性,角蛋白染色阳性。本实验培养的滋养细胞中细胞角蛋白染色阳性率接近95%,波形蛋白阳性的细胞小于5%,以上的结果均可以证明培养的细胞为滋养细胞。2. RT-PCR法证实滋养细胞有瘦素mRNA表达:瘦素于340bp处有着强表达。实验二结果:1.各组细胞膜胰岛素受体及磷酸化胰岛素受体蛋白表达的变化:四组滋养细胞经不同浓度瘦素的培养基培养24小时以后,胰岛素受体蛋白的表达无明显差异,无统计学意义(P>0.05)。磷酸化的胰岛素受体蛋白的表达有着明显差异:瘦素浓度分别为100、250、500μg/L的实验组胰岛素受体的磷酸化水平均显著低于对照组(P<0.05),并随着瘦素浓度的上升,绒毛滋养细胞膜的胰岛素受体磷酸化水平进一步下降。2.各组细胞胰岛素受体底物-1mRNA的表达:四组滋养细胞经不同浓度瘦素的培养基培养24小时后,胰岛素受体底物-1mRNA的表达有着显著差异:浓度分别为100、250、500μg/L的实验组胰岛素受体底物-1mRNA的表达均显著低于对照组(P<0.05),并发现随着瘦素浓度的上升,胰岛素受体底物-1mRNA表达量相应的下降。3.各组细胞胰岛素受体底物-1及磷酸化胰岛素受体底物-1蛋白的表达:用不同浓度瘦素的培养基培养四组滋养细胞24小时以后,胰岛素受体底物-1及磷酸化胰岛素受体底物-1蛋白的表达均有着明显差异:各实验组胰岛素受体底物-1及磷酸化胰岛素受体底物-1的蛋白表达量均显著低于对照组(P<0.05),并发现随着瘦素浓度的上升,滋养细胞的胰岛素受体底物-1蛋白表达及其磷酸化水平均相应下降。结论1.瘦素与胰岛素受体信号转导系统存在着相关性,抑制细胞膜胰岛素受体β亚基的磷酸化可能是其影响胰岛素受体信号转导的机制之一。2.实验组IRS-1的mRNA及蛋白表达、酪氨酸磷酸化程度均明显减弱,提示瘦素可能参与胰岛素受体后信号传导抑制,从而参与妊娠期糖尿病的发生及发展。