论文部分内容阅读
内置生物人工肝是体外生物人工肝技术和肝细胞移植技术的结合，其工作机理与体外生物人工肝相同，应用于机体后可以为肝细胞提供了良好的免疫屏障，防止被机体免疫系统破坏；还为肝细胞正常生长提供了支持界面，肝细胞存活时间更长。它不仅能支持肝脏功能，而且可用于治疗先天性代谢性肝病。本研究即应用聚砜膜中空纤维管和猪肝细胞构建了内置生物人工肝，对其培养最适细胞密度、体外体内功能、应用后对机体细胞因子、病肝的作用进行研究。
第一部分：内置生物人工肝最适细胞密度研究改良两步胶原酶法分离肝细胞，构建内置生物人工肝，体外培养3天，检测细胞活率、安定代谢功能、合成功能(包括尿素合成、蛋白质合成和葡萄糖-6-磷酸酶活性)及总RNA丰度和P53基因表达。结果：各组细胞活率均维持90％以上，差异无显著性(P＞0.05)；安定代谢功能、尿素合成功能、蛋白合成功能类似，细胞数量少于5×106/mL时，随细胞密度的增加而功能增强，细胞密度高于5×106/mL上述功能维持一定水平，各功能在5×106/mL组与1×105/mL、5×105/mL两组比较有非常显著性差异(P＜0.01)；葡萄糖-6磷酸酶和总RNA丰度表现出另一种趋势，细胞密度低于5×100/mL，两者均维持较高水平，其后虽细胞密度增加，出现一定程度下降。总RNA丰度5×107/mL组和密度低的4组比较，差异均有非常显著性(P＜0.01)。细胞内P53基因表达在细胞量5×107/mL时表达明显增强。结论聚砜膜中空纤维管构建的生物人工肝内最适细胞培养密度为5×106/mL。
第二部分：内置生物人工肝体外功能研究构建内置生物人工肝，设置相同细胞密度培养的裸肝细胞对照组、微载体组、中空纤维管组(肝细胞直接培养于聚砜膜中空纤维管内)和内置生物人工肝组(聚集于微载体上的肝细胞培养于聚砜膜中空纤维管内)，对培养在无血清培养基中7天内各组的细胞活率、ALT及LDH释放量、安定代谢功能、合成功能(包括尿素合成、蛋白质合成和葡萄糖-6-磷酸酶活性)进行检测，结果：各组细胞活率均维持在80％以上，组间无差异；ALT及LDH释放量在内置生物人工肝组和中空纤维管组一直维持恒定的低水平(ALT：波动于8.7U/L-21.4U/L，LDH：波动于9.8U/L-23.4U/L)，与对照组和微载体组比较显著降低；安定代谢功能、尿素合成功能、蛋白合成功能和葡萄糖-6-磷酸酶活性均表现了相似特性，内置生物人工肝组均显著高于对照组和中空纤维管组(P＜0.01)，而与微载体组无差异。结论：内置生物人工肝体外培养仅产生少量的ALT和LDH，但具有较高的代谢和合成功能，优于裸细胞培养对照组和中空纤维管组。
第三部分：肝脏缺血合并部分肝切除急性大鼠肝功能衰竭模型研究为了建立一种新型大鼠急性肝功能衰竭模型，采用右叶肝缺血60分钟或90分钟，恢复供血同时切除其余肝脏方法。研究了不同缺血时间制作的模型生存率；观察了60分钟组血氨、部分生化指标随时间自然变化；应用同种异体肝细胞腹腔内移植治疗，观察生存率改善；并且研究模型肝脏病理变化。结果：缺血60分钟组术后血氨、ALT、AKP、总胆红素及凝血酶原时间上升，术后12-24小时变化最为显著；模型随缺血时间的延长，生存率显著降低，缺血90分钟组3天后生存率为零；应用同种异体肝细胞腹腔内移植治疗90分钟组，生存率显著提高，术后2周仍达50％；肝脏病理检查提示典型的肝脏坏死表现，程度上缺血90分钟的模型更为严重，还伴有肝细胞增大、多量双核细胞等肝脏再生现象。结论：肝脏缺血60分钟以上复合部分肝切除可制作可控制严重程度的肝衰模型。第四部分：内置生物人工肝对机体肝功能及细胞因子的影响
为了研究构建的新型内置型生物人工肝的体内代谢支持作用，应用改良两步胶原酶法分离猪的肝细胞，制作内置型生物人工肝；采用部分肝脏切除复合肝脏缺血方法制作大鼠急性肝功能衰竭模型，应用内置型人工肝植入腹腔对模型进行肝功能支持。检测人工肝支持24小时后血氨、凝血酶原时间、部分肝功能指标及一些细胞因子(FGF、TNF-α、IL-1α、IL-6α)，观察大鼠生存率变化，并且取出内置人工肝内的肝细胞检测细胞活率及葡萄糖-6-磷酸酶活性。结果：内置生物人工肝支持组大鼠血氨显著降低，血浆总胆红素也显著下降，ALT和AKP水平也有所降低，但无统计学差异；应用内置生物人工肝治疗显著升高FGF、IL-6α(P＜0.01)，降低TNF-α和IL-1α(P＜0.01)；90分钟缺血模型组大鼠经内置人工肝支持后生存率明显提高(P＜0.01)，而60分钟缺血模型组大鼠生存率支持与否无统计学差异；内置生物人工肝内肝细胞在支持24小时后活率为85％以上，2周时活率仍达75％以上；葡萄糖-6-磷酸酶活性24小时后与2周时同植入前均无无统计学差异。结论：内置型生物人工肝对急性肝功能衰竭大鼠模型有肝功能支持作用，对机体细胞因子也有一定影响，其内细胞可以在腹腔中维持活力2周以上。
第五部分：内置生物人工肝对机体肝脏的作用为研究内置生物人工肝对病肝作用，将内置生物人工肝应用于上述模型，设立正常组(正常大鼠肝脏)及对照组(未治疗模型大鼠病肝)进行对照，对支持治疗后的病肝进行细胞增殖指数、调亡比率和死亡比率测定、C-myc、C-jun及P53基因表达研究、TNFα-R及TGFβ-R蛋白检测及PCNA检测，结果表明相对于对照组，治疗组的细胞增殖指数明显增加，而调亡比率和死亡比率明显降低，C-jun基因和TNFα-R蛋白上调，而P53基因和TGFβ-R蛋白下调，C-myc变化不显著，PCNA阳性细胞在支持治疗组明显增多。结论：应用内置生物人工肝治疗对肝脏再生有一定促进作用，其机理与细胞调亡、C-jun基因和TNFα-R蛋白上调、P53基因和TGFβ-R蛋白下调有关。