铅(Pb)是生态环境中的一种常见污染物,一旦进入生物机体便在体内蓄积并对机体产生损伤。铅对机体的损伤呈多系统和多器官性。肾脏是铅损伤的重要靶器官,且近端小管是铅肾脏损伤的靶部位。细胞自噬是一种进化上高度保守、维持细胞内环境稳态的生物学过程,主要通过溶酶体对胞内长寿蛋白,错误折叠蛋白和受损细胞器进行降解并循环利用。研究表明细胞自噬在多种毒物所致肾脏损伤中发挥重要的保护作用,但细胞自噬在铅所致大鼠肾小管上皮(rPT)细胞毒性中的具体机制尚不清楚。溶酶体是细胞自噬降解过程中的关键细胞器。当外界刺激诱发溶酶体膜通透化时,组织蛋白酶B和组织蛋白酶D从溶酶体释放进入胞浆,可激活细胞凋亡途径而发挥其细胞毒性作用。我们前期研究证实细胞凋亡是低剂量铅(0-1.0μM)暴露所致rPT细胞死亡的主要途径,但溶酶体膜通透化是否参与该过程尚未见报道。鉴于溶酶体在细胞自噬与细胞凋亡中的双重调控作用,本研究以原代rPT细胞为研究对象,重点探讨溶酶体功能异常,细胞凋亡与自噬抑制三者之间的关系,为从分子水平揭示铅对肾脏的毒性损伤机理提供理论依据。首先,本研究对铅所致自噬小体蓄积的原因进行了探究。通过蛋白质免疫印迹技术检测铅暴露不同时间(3,6,12 h)自噬标志蛋白LC3-II的表达情况来反映铅对自噬的影响,筛选出自噬现象最明显时的铅暴露时间和剂量进行后续试验。结果表明铅暴露可引起自噬小体的蓄积,在铅浓度为0.5μM,处理时间为12 h时,自噬小体蓄积最明显。采用两种自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA,自噬前期)和氯喹(CQ,自噬后期)干预自噬,通过共聚焦显微技术检测两种自噬抑制剂对铅所致GFP-LC3瞬时转染的rPT细胞中自噬小体数量变化的影响。采用蛋白质免疫印迹技术检测在两种自噬抑制剂存在或不存在情况下对铅所致自噬标志蛋白LC3-II和p62/SQSTM1表达的影响。通过共聚焦显微技术检测铅对RFP-GFP-LC3瞬时转染的rPT细胞中自噬小体向溶酶体转运的影响,进一步确定铅对rPT细胞自噬流的影响。结果表明铅通过抑制自噬引起自噬小体蓄积。其次,我们对自噬流抑制的具体机制进行了研究。采用内源性LC3免疫荧光着色标记自噬小体,LAMP1免疫着色标记溶酶体,通过共聚焦显微技术检测铅暴露对自噬小体和溶酶体融合的影响。使用Lyso-Tracker Red和Acridine Orange两种溶酶体pH探针标记溶酶体,并通过共聚焦显微技术检测铅对rPT细胞溶酶体pH的影响。随后通过蛋白质免疫印迹技术检测铅对调控细胞溶酶体酸性环境的3种V-ATPase蛋白表达的影响。结果表明铅可能通过抑制2种溶酶体V-ATPases表达而升高溶酶体pH。采用共聚焦显微技术和蛋白质免疫印迹技术分别检测铅对DQ-BSA-Green荧光强度和细胞总组织蛋白酶B、D蛋白表达的影响。研究结果表明铅所致自噬阻滞不是由自噬小体与溶酶体融合受阻引起,而是由溶酶体功能受损(包括溶酶体碱化和溶酶体降解能力降低)引起。最后,我们对溶酶体膜通透化与细胞凋亡的联系进行了研究。采用共聚焦显微技术和蛋白质免疫印迹技术分别检测铅对组织蛋白酶B、D亚细胞分布的影响。同时,采用CA 074(组织蛋白酶B抑制剂)和Pep A(组织蛋白酶D抑制剂)分别预处理rPT细胞随后进行铅染毒,通过蛋白质免疫印迹技术、共聚焦显微技术、流式细胞术分别检测CA 074或Pep A与铅共处理对铅处理所致凋亡标志蛋白caspase-3剪切体、DAPI着染的细胞核形态、细胞凋亡率变化的影响。结果表明铅可引起溶酶体膜通透化,导致组织蛋白酶B、D由溶酶体释放进入胞浆,进而启动细胞凋亡。总之,铅暴露所致溶酶体功能受损(溶酶体碱化和溶酶体蛋白水解酶活性降低)导致自噬抑制,自噬流的阻滞导致肾毒性;铅介导的溶酶体膜通透化可导致组织蛋白酶B、D由溶酶体释放进入胞浆进而启动细胞凋亡,引起肾毒性。