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转移复发是影响HCC术后生存的最大障碍。转移复发的发生与癌细胞的生物学行为(黏附、运动、增殖)、细胞外基质、机体免疫与肿瘤血管生成等许多因素有关。比较蛋白质组学作为多基因、多因素复杂病理机制研究的有效手段,可高通量,大规模地筛检在疾病发生发展中起重要作用的关键蛋白质分子,运用该研究策略,可获得一些传统手段无法得到的新蛋白标志物,新关键分子,极大地丰富诊断标志物的选择组合及复杂致病机理的全面阐明。本研究通过对转移潜能高、低的人肝癌细胞系(MHCC97H/MHCC97L)和不转移人肝癌细胞系(Hep3B)的全蛋白质组表达谱差异分析,筛出一些有潜在应用价值的差异蛋白,同时采用反义核酸技术和与侵袭生物学特性有关的鉴定方法对差异蛋白annexin1和S100A4进行了功能分析和验证。第一部分人肝癌细胞系转移相关分子的比较蛋白质组学分析本部分工作的主要目的:(1)优化双向凝胶电泳(2-DE)相关技术,建立相对稳定、适合本实验室的标准技术平台。(2)运用优化后的2-DE结合液相色谱-电喷雾-串联质谱(LC-ESI-MS/MS)技术,对转移潜能不同人肝癌细胞系中全蛋白质差异表达谱进行分析,筛查在转移过程中发挥重要作用的差异蛋白质分子。2-DE技术是比较蛋白质组学研究的重要支撑技术之一,在比较蛋白质组学分析中,它所起的作用主要是对复杂蛋白质样品进行分离并显示差异蛋白的数量和位置。保持2-DE技术的稳定标准是比较蛋白质组学成功的关键。我们针对影响2-DE蛋白质图谱质量较大的环节,如上样方式(杯上样、溶涨上样)、银染方法(双胺银染法和非双胺化学显色银染法,固定时间)、细胞裂解液组成(离液剂浓度)分别进行了优化比较分析。结果发现同一细胞系MHCC97L采用杯上样、双胺银染法获得的平均蛋白斑点数为1092+40个(n=3),明显多于溶涨上样、非双胺化学显色银染获得的平均蛋白斑点数784+14个(n=3)。非双胺化学显色银染的图谱背景明显深于双胺银染结果,杯上样的碱性区、酸性区蛋白质分离效果明显优于溶涨上样。由于采用双胺银染法获得的蛋白斑点数远多于非双胺化学显色银染,前者胶中表达弱的点在后者胶中有匹配,说明双胺银染法敏感性优于非双胺化学显色银染法。与溶涨上样相比,杯上样可显著提高碱性区、酸性区蛋白质分离效果。同一L02细胞系经含不同浓度离液剂的细胞裂解液处理,平均获得的蛋白斑点数差异较大,分别为925+11个(7M尿素+2M硫脲,n=3),1019.5+13.5个(9M<WP=5>尿素,n=3),781+34个(8M尿素,n=3)。上述结果表明离液剂浓度改变对蛋白斑点的获得影响较大。不同固定时间(双胺银染法)影响蛋白质条带的显示,固定方式A(40%乙醇10%乙酸固定1h,后5%乙醇5%乙酸固定过夜)条带显示最多;固定方式B( 40%乙醇10%乙酸固定1h。)条带显示次之;固定方式C(5%乙醇5%乙酸固定过夜)条带显示最少。固定方式A得到的蛋白质银染图谱理想,建议用于蛋白成分复杂图谱的显示。3种转移潜能不同人肝癌细胞系的蛋白质样品,在相同条件下分别进行3次双向电泳,Hep3B平均检测到976+112个蛋白点(n=3),MHCC97L平均检测到1092+40个蛋白点(n=3),MHCC97H平均检测到888+15个蛋白点(n=3),以其中点数最多的一块MHCC97L图谱作为参考胶,Hep3B与其匹配的平均匹配点数为637+37个(n=3),MHCC97L与其匹配的平均匹配点数为771+16个(n=2),MHCC97H与其匹配的平均匹配点数为589+51个(n=3),平均匹配率分别为65.7 %,72.1%,66.2%。不同胶间蛋白质斑点的位置偏差IEF(等电聚焦)方向为2.95+ 0.95mm,SDS-PAGE方向为2.87+0.88mm。Hep3B、MHCC97L、MHCC97H中有359个蛋白质点匹配。与Hep3B比,MHCC97L有103个点未匹配,相差10倍以上的上调点有57个,相差10倍以上的下调点有49个;MHCC97H有113个点未匹配,相差10倍以上的上调点有47个,相差10倍以上的下调点有52个。质谱鉴定出S100A4,S100A6,S100A11,annexin 1等26种胶内差异蛋白质。部分差异蛋白如annexin1和S100A4等在转移与不转移人肝癌细胞系中为最新发现。由于转移性肝癌细胞系全蛋白质表达谱与不转移人肝癌细胞系比差异明显,推测肝癌侵袭转移性与细胞内多种差异蛋白的改变相关。第二部分 转移潜能不同人肝癌细胞系差异蛋白的再验证及功能分析对差异蛋白annexin1和S100A4的功能解析是本研究的另一个重要目标。由于两种差异蛋白是从转移与不转移的人肝癌细胞系蛋白质表达谱的差异比较中筛选出来的,因此一系列与侵袭转移有关的细胞生物学功能的检测成为课题的重点。为保证差异蛋白初筛结果的可信及下游分析的确定性,我们首先对差异蛋白结果进行了再验证,应用RT-PCR,Western blot,细胞免疫化学证实annexin1和S100A4的确在有转移潜能人肝癌细胞系(MHCC97H和MHCC97L)中高表达。采用反义RNA技术策略,分别构建pcDNA3.1(+) AS annexin1表达质粒和<WP=6>pcDNA3.1(+) AS S100A4表达质粒,转染高转移潜能人肝癌细胞系MHCC97H,观察annexin1和S100A4蛋白表达降低对MHCC97H细胞生物学行为(包括运动、侵袭、MMPs分泌、凋亡等)的影响。侵袭实验显示穿过人工基底膜细胞数分别为:5.0+1.414(MHCC97H/ pcDNA3.1(+) AS S100A4),16.43+2.225(MHCC97H/pcDNA3.1(+) AS annexin1),16.4+1.574 (MHCC97H/ pcDNA3.1(+)),16.86+