论文部分内容阅读
垂体,作为连接神经系统和内分泌系统的枢纽,通过控制内分泌负反馈循环调控个体的生长、发育和增殖等。为了研究垂体在银鲫生殖发育的信号调控网络,我们利用深度转录组测序分析人工催产前后垂体基因的表达变化。经过荧光定量RT-PCR验证,我们发现了雌激素应答基因greb1在人工注射催产激素后上调表达,且在催产后6-8小时达到峰值,随后降低。由于greb1是雌激素和多种激素的应答基因,结合银鲫在人工催产6-8小时后开始产卵,greb1在银鲫卵母细胞成熟过程中垂体的动态表达模式暗示greb1很有可能参与调控鱼类卵母细胞成熟和产卵过程。鉴于此,我们在我国重要经济鱼类银鲫和模式生物斑马鱼中,对greb1基因的表达模式和功能进行了分析。 根据转录组测序的结果,我们首先设计引物在银鲫垂体SMART cDNA文库中,克隆得到CgGreb1的cDNA全长。成体组织RT-PCR分析显示CgGreb1主要在脑、垂体、肝脏和性腺中表达。接着,我们利用RT-PCR和胚胎整体原位杂交(WISH)描述了CgGreb1在胚胎发育时期的表达模式。RT-PCR结果显示,CgGreb1从原肠期开始表达,其表达量在24 hpf达到峰值,随后降低,至48 hpf完全消失。WISH结果显示,在原肠期时CgGreb1在胚层的边缘表达;在体节发生过程中,CgGreb1逐渐开始在中枢神经系统表达。进一步,显微注射morpholino敲降CgGreb1的表达会导致银鲫垂体发育和垂体细胞的分化受损。 斑马鱼greb1与银鲫greb1的表达模式十分相似。利用TALEN敲除技术,我们获得了缺失8个碱基并导致新的终止密码子出现的greb1纯合突变的斑马鱼品系(greb1-/-)。通过对WT胚胎和greb1-胚胎的表型进行观察,我们发现在受精后6小时,greb1-/-胚胎与WT胚胎没有明显的差异。但是,在受精后9小时,greb1-/-胚胎呈现明显的外包滞后;在受精后26小时,约有24%的greb1-/-胚胎死亡,幸存下来的胚胎脑部呈现明显的畸形。在受精后6小时,利用WISH检测内胚层标记基因foxa3、内中胚层标记基因gsc和中胚层标记基因ntl的表达情况,结果表明greb1-/-胚胎的胚层分化并没有受到影响。在受精后10小时,通过检测早期胚胎发育标记基因myod、ntl、otx2、zic1、hgg、dlx3b和papc的表达情况,发现greb1敲除影响了胚胎的汇聚延伸运动。在受精后26小时,通过检测中枢神经系统标记基因neurod6b、tbr1b、otx2、pax6b、dlx5a、fezf2、pax2a和zic1的表达情况,发现greb1敲除导致胚胎腹部脑区的发育受到了明显的抑制,尤其是间脑。为了确认greb1敲除是否会影响垂体的发育,我们通过荧光定量PCR和WISH检测和分析了受精后48小时一些垂体细胞的标记基因,发现gh,tshβ,prl以及gthα的表达明显减少。 此外,我们发现受精后20天,greb1-/-幼鱼的死亡率约为69%,而幸存的greb1-/-幼鱼在随后的生长过程中,呈现明显的生长障碍。三月龄的greb1-/-斑马鱼的体长减短了约20%,体重减少了约50%,垂体中7种激素基因的表达量减少了35%-70%,血清中GH、PRL、TSH、FSH和LH激素含量减少了35%到50%。 我们的结果揭示了greb1参与了HPG轴的生殖调控,并且对硬骨鱼类垂体的发育及内分泌调控发挥重要作用。