论文部分内容阅读
研究目的:探讨芎归方的活性成分藁本内酯（LIG）能否通过调节NLRP3/Caspase-1通路在体外神经炎症模型中减轻炎症反应,发挥抗炎作用,为缺血性卒中相关神经炎症的治疗提供实验依据。研究方法:1.LPS刺激BV2细胞制备体外炎症模型:BV2细胞种于96孔板用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养24小时之后,换为无血清的DMEM高糖培养基,并加入LPS使其终浓度为100 ng/ml,干预24小时制备炎症模型,用于造模后细胞活力检测和药物浓度筛选。2.实验分组如下:（1）对照组（control组）:正常培养细胞;（2）模型组（LPS组）:100 ng/ml的LPS干预细胞24小时;（3）藁本内酯组（LIG组）:不同浓度LIG预先干预细胞1小时,之后同100 ng/ml的LPS干预24小时;（4）激活剂组（ATP组）:细胞正常培养24小时后添加终浓度2.5 m M ATP干预30分钟;（5）抑制剂组（MCC950组）:10u M MCC950预先干预细胞1小时,之后同100 ng/ml的LPS干预24小时;（6）LPS+ATP+LIG组:40 u M LIG预先干预细胞1小时,之后同100 ng/ml的LPS干预24小时,添加终浓度2.5 m M ATP干预30分钟。3.采用CCK-8细胞增殖活性检测试剂盒检测不同浓度LIG对BV2细胞以及造模后细胞活力的影响,筛选LIG的适宜药物浓度。qRT-PCR法检测LIG对LPS干预的BV2细胞促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的影响。通过相差显微镜观察LIG干预后细胞形态的改变。4.添加NLRP3炎症小体的激活剂ATP和抑制剂MCC950,LIG的浓度选取40 u M用于实验。qRT-PCR法检测促炎细胞因子IL-1β、NLRP3的mRNA表达水平。Western blot法检测NLRP3通路相关蛋白（NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1）以及下游IL-18、pro-IL-1β、mature-IL-1β的蛋白表达水平。研究结果:1.CCK-8检测结果显示LIG浓度≤40 u M时对BV2细胞活力没有明显影响（P＞0.05）。qRT-PCR法检测结果显示,LPS诱导激活BV2细胞后,TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平显著升高（P＜0.0001）,而LIG干预可以有效抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的表达（P＜0.01,P＜0.001,P＜0.0001）,且存在剂量-效应依赖性。镜下观察细胞形态,正常对照组大部分细胞为圆形或卵形,分支小,经LPS刺激后分支增多且呈现细长树枝状,经LIG干预后可使细胞形态得到一定改善。2.qRT-PCR法检测结果显示LPS干预BV2细胞后IL-1β和NLRP3的mRNA表达水平显著升高（P＜0.0001）,经LIG或抑制剂MCC950干预后,与LPS组相比IL-1β和NLRP3表达显著下调（P＜0.0001）。LPS组与ATP组相比IL-1β和NLRP3的mRNA表达水平更高（P＜0.0001）。LIG组和MCC950组相比,MCC950组优于LIG组（P＜0.05）。与LIG组相比,LPS+ATP+LIG组IL-1β和NLRP3的mRNA表达水平升高（P＜0.05,P＜0.01）。3.Western blot检测结果显示LPS干预后NLRP3通路相关蛋白（NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1）以及下游IL-18、pro-IL-1β、mature-IL-1β的蛋白表达水平升高（P＜0.05）,经LIG或抑制剂MCC950干预后蛋白表达下降（P＜0.05）,其中pro-IL-1β经LIG干预后虽有下降趋势但无统计学差异（P＞0.05）,与LIG组相比,LPS+ATP+LIG组Pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1、IL-18、mature-IL-1β蛋白的表达水平升高（P＜0.05）。与ATP组相比,LPS组在NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、matureIL-1β蛋白表达水平上显示出更强的刺激效果（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.0001）。研究结论:1.LIG可有效抑制LPS刺激的BV2细胞活化,改变激活后的细胞形态,发挥抗炎作用。2.LIG可部分通过NLRP3/Caspase-1通路抑制IL-1β和NLRP3的mRNA表达以及NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1、IL-18、mature-IL-1β蛋白的表达,减轻细胞炎症反应,发挥抗炎作用。