研究背景二硫化碳(Carbon disulfide, CS2)是工业上常用的有机溶剂,也是重要的化工原料,在粘胶纤维的生产和加工过程中女工接触人数众多。流行病学研究结果表明：CS2作业女工自然流产率、早早孕丢失率、子代先天缺陷率均较对照人群明显升高,提示CS2具有生殖和发育毒性。我们课题组前期工作发现,小鼠在胚胎植入期(GD4-GD6)暴露于CS2可明显降低胚胎植入数目,证实了小鼠暴露于CS2同样引起胚胎损伤现象的发生。但是,CS2致胚胎毒性的具体机制尚未明确。胚胎植入(embryo implantation),是指活化状态的胚泡与容受状态的子宫相互作用,使滋养层与子宫内膜建立紧密联系的过程,涉及多种物质的参与。胚胎学研究结果显示,粘附分子中的整合素αvβ3是子宫内膜容受性的标志分子,其表达受孕酮(Progesterone, P4)和雌二醇(Estradiol, E2)的调控；白血病抑制因子(Leukaemia inhibitory factor, LIF)在“着床窗”期的子宫内膜中特异性表达,对整合素αvβ3有明显的促进作用；survivin在子宫内膜的表达与胚胎植入过程相一致,可能通过抑制细胞凋亡促进子宫内膜的蜕膜化,参与胚胎植入过程。此外,整合素αvβ3对survivin蛋白的表达具有上调作用。上述结果表明,LIF与survivin分别是整合素αvβ3的上游和下游调控蛋白。因此,本研究以胚胎植入期为切入点,以整合素αvβ3及其相关蛋白为研究指标,从子宫内膜粘附性的角度探讨CS2致胚胎毒性作用机理。研究目的构建胚胎植入期不同时间点暴露于CS2致小鼠胚胎植入障碍动物模型,观察小鼠胚胎发育和胚胎植入障碍现象与不同暴露时间之间的关系及其时间变化规律；检测不同暴露时间不同观察终点孕鼠子宫组织中整合素β3、LIF、survivin蛋白表达水平及血清P4和E2浓度,分析CS2暴露致胚胎植入障碍与粘附分子相关蛋白表达和激素水平之间的关系及其致病机制,以揭示植入期暴露CS2致胚胎毒性作用机理,为CS2作业女工劳动保护措施的修订提供理论依据。研究方法1.建立胚胎植入障碍时间依赖动物模型雌性小鼠经腹腔注射10U孕马血清(PMSG),48h后注射10U人绒毛膜性腺激素(HCG),按雌雄1：1交配合笼,次日检查阴栓,阴栓阳性者记为孕第1天(GD1)。将孕鼠随机分为GD3、GD4、GD5、GD6暴露组和对照组,分别在GD3、GD4、GD5、GD6按631.4mg/kg (0.4LD50)的剂量经腹腔注射CS2一次,对照组给予橄榄油。每组又根据各自的暴露时间点分别设、GD5、GD6、GD7、GD9相应的观察终点结束实验,称取胚胎、子宫、卵巢、肝、脾、肾等的重量,保存子宫组织标本和血清；计数GD9观察终点胚胎植入数目。2.检测母鼠子宫组织粘附分子相关蛋白表达水平将暴露组与对照组孕鼠子宫组织经匀浆后的上清液进行蛋白定量分析,采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹法(Western blotting)测定粘附分子相关蛋白表达相对含量。蛋白条带经扫描后分析其积分吸光度值(integrated optical density, IOD)。3.测定母鼠血清性激素水平采用酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定暴露组与对照组母鼠血清性激素水平。4.统计分析方法采用Excel建立数据库,用SPSS16.0软件进行统计分析。首先对各指标进行方差齐性检验：若方差齐,单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)进行F检验,同时选择Dunnett-t test进行实验组与对照组指标均数比较；若方差不齐,采用非参数统计方法(Kruskal-Wallis H法)。采用两个独立样本t检验(Independent-Samples T Test)进行实验组和对照组均数比较,统计学检验水准设为α=0.05。研究结果1.胚胎植入期暴露CS2所致胚胎毒性作用母体毒性：胚胎植入期不同时间点暴露CS2可导致孕鼠GD9体重和总体重增重降低,但净体重增重组间比较差异不具有统计学意义(P=0.08)。母鼠子宫、卵巢、肝、脾、肾等脏器重量及脏器系数在各处理组间的差异均无统计学意义。说明该暴露剂量致母体毒性作用相对较小胚胎毒性：GD4和GD5暴露CS2明显减少胚胎植入数目(P=0.01和0.02)；GD4和GD5暴露CS2均可明显降低胚胎窝重(P=0.020和0.021),校正孕鼠体重与植入数目之后,每窝胚胎重量组间比较差异无统计学意义；植入期暴露CS2对宫胚窝重、宫胚窝重/体重、宫胚窝重/植入数目均无明显影响。说明小鼠在胚胎植入期暴露于CS2可明显减少植入数目,引起胚胎毒性作用。2.CS2暴露对母鼠子宫组织粘附分子相关蛋白表达的影响胚胎植入期不同时间点暴露CS2均可导致母鼠子宫组织LIF表达水平在各自相应的第一个观察终点显著降低(P<0.05),且GD3暴露组在GD5和GD6观察终点的LIF表达水平也明显降低(P<0.05)。各暴露组在GD7观察终点的整合素β3相对含量显著低于对照组(P<0.05),并且GD3暴露组在GD4和GD5观察终点的整合素β3表达水平显著下降(P<0.01)。提示,植入期GD3暴露CS2对LIF和整合素β3表达均产生明显的干扰作用,整合素β3改变出现时间晚于LIF。植入期各CS2暴露时间的不同观察终点均未观察到子宫组织survivin表达水平的明显改变。提示植入期CS2暴露对survivin影响相对较小胚胎植入数目与母鼠子宫组织粘附分子相关蛋白表达水平之间的双变量相关分析结果显示,植入数目与LIF的Spearman等级相关系数为0.327(P=-0.037),与整合素p3的相关系数为0.289(P=0.025),与survivin的相关系数无统计学意义(r=0.188,P=0.151)。提示CS2暴露致孕鼠胚胎植入数目减少与母鼠子宫组织LIF和整合素β3表达水平降低呈正相关,与母鼠子宫组织survivin表达水平之间无明显相关关系。3.CS2暴露对母鼠血清性激素含量的影响胚胎植入期不同时间点(GD3、GD4、GD5)孕鼠暴露于CS2可对GD6观察终点的母鼠血清P4水平产生明显影响(P<0.01),GD5和GD6暴露CS2导致GD9观察终点的P4水平降低(P<0.05)。孕鼠植入期暴露于C82均可导致GD7和GD9观察终点的血清E2水平明显降低(P<0.05),GD3和GD5暴露可对GD6观察终点E2水平产生不同程度干扰(P=0.016和0.055)。提示,CS2暴露对母鼠血清P4水平的影响主要是在GD6和GD9,对E2的影响主要集中在GD7和GD9。胚胎植入数目与母鼠血清P4和E2水平之间的双变量相关分析结果显示,植入数目与P4和E2的Spearman等级相关系数分别为0.119和0.102(P为0.365和0.438),说明CS2暴露致孕鼠胚胎植入数目减少与母鼠性激素水平之间无明显关联。结论1.小鼠胚胎植入期暴露于CS2可导致明显的胚胎毒性,GD4和GD5暴露致胚胎丢失明显。2.植入期暴露CS2可降低小鼠子宫组织LIF和整合素p3表达水平,且植入数目减少程度与粘附分子蛋白低表达之间存在明显的正相关关系。提示蛋白表达水平的降低可能是CS2暴露致胚胎毒性的重要机制之一3.植入期暴露CS2可降低小鼠血清P4和E2水平,但激素水平改变明显在粘附分子LIF和整合素β3改变之后,且植入数目减少程度与激素水平之间无明显相关关系。提示小鼠胚胎植入期暴露于CS2通过引起LIF和整合素粘附分子低表达导致胚胎植入障碍,激素水平改变对其影响作用较小。该现象尚需进一步研究证实。