3D打印技术已逐渐被应用于钛合金,聚甲基丙烯酸甲酯和聚醚醚酮等颅骨修复植入物的制造,以便能更加方便、高效、准确的加工此类具有特定形状需求的植入物。然而随着颅骨成形术的目标开始从外形重建向骨再生进展,现阶段的3D打印形式仍主要集中在颅骨植入物的形状与骨缺损的匹配上,缺乏实现骨再生的理想材料和活细胞。这显然不能满足颅骨缺损修复的骨再生需求。迄今为止,已被证实具有促进骨再生作用的生物材料中,其中多数仍然存在成本高、异源性、骨再生能力有限等缺点。而且长期的异源性材料植入和异源性细胞的使用不可避免会引起异物反应或免疫排斥。自体颅骨瓣因其在生物来源上具有真正的患者特异性而常被作为颅骨修复材料的首选,却因创伤性颅脑损伤、缺损面积过大、骨瓣碎裂、颅骨修复时间晚等不利因素而出现无菌性骨坏死并最终演变为骨瓣吸收。此外,处于颅骨关键生长期的儿童因活跃的骨质重构而更易出现骨瓣吸收。本研究从个性化颅骨修复再生的角度出发,提出包括外形特异、材料来源特异(自体骨基质)和细胞来源特异(自体细胞)的多元个性化3D打印植入物解决方案,拟以自体颅骨瓣为原料制造具有材料特异性的3D打印自体颅骨植入物,通过结合自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)进一步构建多元个性化颅骨修复植入物。并在不使用外源性成骨活性因子的情况下,对此植入物的体内和体外成骨能力进行评估,以期提供一种真正兼具患者特异性和骨再生能力的颅骨缺损修复解决方案。第一部分3D打印自体骨个性化外形与结构的实现及特性研究【目的】探索建立以自体骨瓣为原料的3D打印体系的可行性;测试该3D打印体系在特异外形和结构方面的稳定性、实用性和多样性;评价该体系下3D打印自体骨的理化特性。【方法】低温研磨冻干的兔自体骨瓣获得骨粉并在电镜下进行微观形貌观察,使用激光粒度分析仪测量粒度分布;将自体骨粉与多种溶剂制备的聚(ε-己内酯)(PCL)墨水混合获得骨浆料,评价不同溶剂下自体骨浆料的可打印性;在优化的3D打印参数下,以不同填充率及层间角度进行简易模型及基于人体影像数据的成人尺寸模型打印;电镜下观察3D打印自体骨的微观形貌,以万能测试机进行力学强度测试;以样品浸提液孵育L929小鼠成纤维细胞系,评价样本细胞毒性。【结果】兔自体骨瓣的骨粉得率约47%,骨粉粒径达微米级;以冰乙酸为溶剂的自体骨浆料打印流畅且易于成型,浆料可顺利通过的打印喷头最小规格为22G;打印模型可只经过水处理达到固化作用。通过基于冰乙酸的自体骨浆料可以实现多种结构、多种规格的样品打印;电镜下的微观结构呈海绵样,其杨氏模量为3.50±0.73MPa,水处理72h后细胞毒性达到0级。【结论】(1)以自体骨瓣为原料建立3D打印体系是可行的;(2)基于冰乙酸PCL打印墨水的自体骨浆料体系具有良好的打印稳定性、实用性和多样性;(3)3D打印自体骨具有一定的力学强度和良好的生物安全性。第二部分自体BMSCs的分离、培养及多细胞分化潜能鉴定【目的】使用骨髓血进行自体BMSCs的分离和体外培养,并通过诱导其向多种细胞分化证实其多向分化潜能。【方法】取兔股骨上端骨髓血,密度梯度离心获得单核细胞后贴壁筛选培养,并通过Alamar Blue实验检测P3自体BMSCs的增殖能力;诱导对数生长期的P3 BMSCs分别向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞定向分化,以检测细胞的多向分化潜能。标记细胞以确保其与对应的自体骨瓣来自同一个体。【结果】自体BMSCs呈梭形,束状排列,当细胞传代培养至P3时细胞形态更加均一;P3自体BMSCs在第3天进入对数生长期,到达第13天时进入平台期。成骨诱导后碱性磷酸酶(ALP)四唑氮蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(NBT/BCIP)染色及细胞外钙盐茜素红S染色、成脂诱导后细胞内脂滴油红O染色及成软骨诱导后细胞外硫酸糖胺聚糖阿利辛蓝(pH1.0)染色均呈阳性。【结论】(1)密度梯度离心联合贴壁筛选获得的自体BMSCs具有良好的生长活性和多向分化潜能;(2)自体BMSCs有望用于3D打印自体骨以构建多元个性化颅骨修复植入物。第三部分3D打印自体骨对自体BMSCs的细胞亲和性研究【目的】明确自体BMSCs在3D打印自体骨上的初始粘附率,增殖情况以及细胞活力。【方法】将对数生长期P3自体BMSCs种植于3D打印自体骨24h后行CCK-8实验,以2D培养同样数量的BMSCs为参照,计算BMSCs的相对有效粘附率;隔天行Alamar Blue实验,检测自体BMSCs在3D打印自体骨中的增殖情况;分别于不同时间点行细胞活/死染色,计算自体BMSCs的细胞存活率;电镜下观察3D打印自体骨中自体BMSCs的细胞形态。分别以纳米羟基磷灰石(nHA)和异体骨粉为原料的3D打印nHA骨及3D打印异体骨设为对照组。【结果】3D打印自体骨对自体BMSCs的细胞粘附率最高;细胞数量在三种3D打印骨中于第15天达到峰值并保持4天;整个培养过程中,3D打印自体骨和3D打印nHA骨中BMSCs的细胞活力明显强于3D打印异体骨;培养第14天时,扫描电子显微镜(SEM)下发现3D打印自体骨中的细胞在形态上与成骨细胞类似,3D打印nHA骨中的细胞仍保持BMSCs的细胞形态,3D打印异体骨中的细胞则出现老化迹象。【结论】(1)3D打印自体骨对自体BMSCs具有良好的细胞亲和性;(2)自体BMSCs在3D打印自体骨中有自发向成骨细胞分化的可能;(3)自体BMSCs与3D打印自体骨结合有望构建出具有骨再生能力的多元个性化自体骨植入物。第四部分3D打印自体骨中自体BMSCs的体外成骨能力研究【目的】明确3D打印自体骨中自体BMSCs自发向成骨细胞分化的能力,为具有骨再生能力的多元个性化3D打印自体骨构建提供分子生物学支持。【方法】于不同时间点对3D打印自体骨中的BMSCs进行ALP活性检测;分别于培养7d、14d及21d应用实时定量聚合酶链式反应进行runt相关转录因子2(RUNX2)、ALP、I型胶原α1片段(COL1A1)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙蛋白(OCN)等成骨分化相关基因表达检测;3D打印nHA骨及3D打印异体骨设为对照组。【结果】在没有外源性成骨因子的情况下,3D打印自体骨中细胞的ALP活性更早、更显著的升高;RUNX2、ALP、COL1A1、OPN和OCN等成骨分化相关基因表达的变化趋势均提示3D打印自体骨中的自体BMSCs更易自发向成骨细胞分化。【结论】(1)3D打印自体骨中的自体BMSCs能更好地自发向成骨细胞分化;(2)3D打印自体骨和自体BMSCs为构建多元个性化自体骨提供了良好的分子生物学基础。第五部分多元个性化3D打印自体骨修复兔颅骨极限缺损的骨再生研究【目的】结合3D打印自体骨及自体BMSCs,构建多元个性化3D打印自体骨;通过兔颅骨极限缺损模型验证这种多元个性化植入物在体内的骨再生能力。【方法】建立兔颅骨极限缺损模型;按上述方法制备3D打印自体骨并提取自体BMSCs;将自体BMSCs种植于3D打印自体骨构建多元个性化骨植入物;建模1月后将多元个性化自体骨回植,3个月后收获标本;通过微型计算机断层扫描(MicroCT)分析新骨矿化,通过HE染色、Masson三色染色、I型胶原和OCN免疫组化分析进一步评估新骨生成情况,通过血管性血友病因子(vWF)免疫荧光分析评估新骨血管生成情况;同样方法应用于无细胞的3D打印自体骨、携带细胞及无细胞的3D打印nHA骨以对比评估其体内成骨能力。【结果】Micro-CT分析结果提示多元个性化自体骨能更有效的促进矿物形成和沉积进而形成矿化新骨;HE染色显示植入物内部的新生骨围绕打印纤维丝生成,并在新骨边缘可观察到明显的活跃成骨细胞;新骨大部分被Masson三色染色染成红色,提示新骨为成熟骨;新生骨的I型胶原免疫组化染色呈阳性;OCN免疫组化染色在新生骨内部及边缘均呈阳性,提示新骨仍处于成骨的活跃状态;vWF免疫荧光染色显示部分成熟骨生成了内生性血管;无细胞3D打印自体骨的打印纤维丝周围也有新骨生成,但骨成熟度和成骨活性均弱于多元个性化自体骨;在3DP打印nHA骨中只观察到一点初始形成的类骨组织,并且当结合BMSCs时只形成了极少量的新骨。【结论】(1)多元个性化自体骨具有良好的天然骨再生能力,具备了患者特异性骨再生植入物的基本特性;(2)这种多元个性化颅骨植入物的制造为实现真正患者特异性的颅骨缺损修复再生提供了可行性;(3)无细胞3D打印自体骨的骨再生能力较弱,可作为多元个性化自体骨的次选方案。