在中枢神经系统里信息的传递依赖神经元之间的联系。近些年来,越来越多的研究发现星型胶质细胞在信息处理的过程中起着很重要的调节作用。因此,星型胶质细胞与神经元之间的化学突触一起被称为“三方突触”。星型胶质细胞膜表面表达了很多不同种的神经递质受体,其中主要是G蛋白偶联受体,例如代谢型谷氨酸受体和P2Y1受体。神经元活动释放的神经递质激活了星型胶质细胞,反过来星型胶质细胞也能释放“胶质递质”,例如D-丝氨酸V(D-Serine)、谷氨酸v(Glutamate)和三磷酸腺苷(ATP)。D-丝氨酸是NMDA受体的协同激活剂。研究证明D-丝氨酸通过结合在NMDA受体的甘氨酸结合位点能增强NMDA受体的激活并因此在离体和在体上都能促进长时程增强(LTP)的诱导。药用或者电刺激神经元能引起星型胶质细胞内钙离子浓度的升高,进而导致释放谷氨酸,反过来通过激活突触外NMDA受体引起周边神经元的慢性内向电流。另外的研究也证明从星型胶质细胞释放的谷氨酸通过激活突触外的含有NR2B亚基的NMDA受体或者1类代谢型谷氨酸受体促进突触前的神经递质释放。作为一个信号分子,在神经科学领域对ATP的研究吸引了越来越多的关注。ATP能介导星型胶质细胞之间钙波的传递。被外源酶降解为腺苷(adenosine)后,通过激活神经元腺苷A1受体抑制了其动作电位的发放。神经元释放的谷氨酸能激活并引起星型胶质细胞的ATP释放。反过来,离体上通过直接激活突触前的P2Y受体ATP能引起异突触的抑制。然而在体上ATP通过降解为腺苷并作用于突触钱的A1受体引起异突触的抑制。在一种星型胶质细胞特异性表达失活SNARE片段的转基因老鼠体内,星型胶质细胞释放ATP被阻断,细胞外的腺苷水平低,进而导致了兴奋性的场电位增强。这个研究证明了星型胶质细胞来源的ATP对于调解神经元的活动起着很重要的作用,并提示ATP是通过胞外分泌的方式释放的。另外,研究还证明了ATP通过溶酶体以受钙离子依赖的胞外分泌的方式释放。病理方面,嘌呤信号通路参与了很多疾病的发生或者治疗,例如癫痫。研究发现在由匹鲁卡品诱导的大鼠癫痫模型上,腺苷能降低癫痫的发作。一种能有效治疗反复发作的癫痫的生酮饮食被证明是通过降低腺苷酶的活性进而增强了腺苷A1受体的激活引起的。综上所述,星形胶质细胞及其分泌的ATP对神经元功能的调解起着很重要的作用。然而,神经元和星形胶质细胞之间的功能联系调解机制并不是很清楚。LRP4属于低密度脂蛋白受体家族。作为一个单跨膜蛋白,LRP4的胞外段很长,拥有多个LDLR重复序列,EGF片段以及p-螺旋重复序列。缺乏LRP4蛋白的老鼠出生后无法生存,因为不能生长神经肌肉接头(NMJ)。后来研究发现LRP4是Agrin蛋白的协同受体,并且对于介导Agrin的信号传递是充分且必要的。研究进一步证明来源于肌肉的LRP4蛋白作为一个逆行信号能调节NMJ的突触前分化,然而来源于运动神经元的LRP4对于NMJ的生成是可有可无的,尽管它对于突触后的分化有一定的促进作用。鉴于NMJ是研究突触发育很有用的模型,以及LRP4蛋白同样在大脑里面表达,研究LPR4在大脑里面的功能就充满了吸引力。截止目前,除了很少的文章报道了LRP4存在于突触后区域并通过C末端PDZ片段和PSD95结合,以及作为载脂蛋白E(apoE)的受体调解神经元的存活之外,我们对LRP4在大脑里的功能知道的很少。为了研究LRP4在大脑里的功能,我们构建了不同种的LRP4条件基因敲除老鼠。其中GFAP-Cre; LRP4f/f老鼠是大脑特异LRP4敲除老鼠,免疫印迹显示LRP4蛋白完全从大脑里敲除。GFAP-Cre;LRP4f/f老鼠拥有正常的体重,大脑结构完好,神经元和星型胶质细胞的数量与正常老鼠无差别(体重：P=0.518；皮层神经元密度：P=0.05；海马星形胶质细胞密度：P=0.402)。有趣的是,当我们给老鼠体内注射匹鲁卡品去诱导癫痫时,GFAP-Cre;LRP4f/f老鼠身上的癫痫发作与正常老鼠比起来总是很缓慢(P=0.011)。用另外一个药物(PTZ)诱导癫痫同样出现缓慢发作的现象(P=0.023),提示了GFAP-Cre;LRP4f/f老鼠大脑里神经元活动的异常。紧接着我们用电生理的方法记录神经元的活动,发现来自GFAP-Cre;LRP4f/f老鼠的海马神经元总是出现更低的自发放频率(P=0.002),阻断抑制性神经元的活性并不能消除这种差别以及兴奋性神经元本身的兴奋程度没有变化(BMI：P=0.038；兴奋性：P=0.94),暗示GFAP-Cre;LRP4f/f老鼠海马内兴奋性的输入强度减弱了。另外实验发现自发放的兴奋性突触后电流(sEPSC)的频率降低(P=0.017),然而幅度没有变化(P=0.358),以及抑制性突触后电流(sIPSC)频率和幅度都没有较大变化(频率：P=0.381；幅度：P=0.563),进一步证明了兴奋性输入强度的减弱。同样的,我们在另外一种大脑LRP4敲除老鼠(即在全身敲除的背景上只在肌肉上过表达LRP4,此老鼠能存活)身上发现了相似的结果(sEPSC频率：P=0.015；幅度：P=0.545；sIPSC频率：P=0.848；幅度：P=0.754),更加强了实验结果的可靠性。兴奋性的输入强度减弱可以有以下可能的原因造成：1.介导兴奋性活动传递的树突脊数量减少。2.突触后的功能受损,例如AMPA受体功能障碍或者数量减少。3.突触前谷氨酸神经递质释放减少。为了寻找兴奋性输入减弱的原因,首先我们做了golgi染色去比较树突脊的密度,发现GFAP-Cre:LRP4f/f老鼠大脑内海马神经元树突脊密度与对照老鼠无差别(P=0.784)。紧接着我们记录突触后AMPA受体和NMDA受体的通道特性以及它们之间的比值,都没有发现有显著的差别(AMPA:P=0.204； NMDA:P=0.883；比值：P=0.652),暗示突触后功能完好。为了检测突触前的递质释放,首先我们记录了配对脉冲比率(paired-pulse ratios),GFAP-Cre；LRP4f/f老鼠海马神经元表现更强的比值(P=0.000),提示突触前释放发生异常。然后我们用NMDA受体的阻断剂MK-801去检测NMDA电流消减的速率(MK-801 block assay),同样发现GFAP-Cre；LRP4f/f老鼠的海马神经元消减的速率更低(P=0.004)。最后我们利用最小刺激方法(minimal stimulation approach)检测突触前递质释放的概率。与对照组比较,递质释放的概率更低(P=0.013),然而效能(potency)无变化(P=0.901),进一步证明了兴奋性输入减弱是由于突触前的降低的递质释放而非突触后引起的。突触前的递质释放降低由两种可能原因造成：1.神经元轴突末梢发育异常。例如,神经递质囊泡数量的减少或者囊泡的体积较小。2.未知的调节信号抑制了突触前的递质释放。为了寻找递质释放的原因,首先我们利用电镜检测了海马谢弗侧支(Schaffer cillateral)区域的突触,发现GFAP-Cre;LRP4f/f老鼠海马内突触的数量,PSD的长度,囊泡的数量和直径都没有显著的变化(突触数量：P=0.707；PSD长度：P=0.203；囊泡数量：P=0.737；直径：P=0.439)。提示了我们GFAP-Cre；LRP4f/f老鼠神经元轴突末梢发育正常。神经元轴突末梢内的囊泡分布在储备池(Reserve pool),循环池(Recycling pool)和易释放池(Readily releasable pool)里。其中易释放池与神经递质的释放密切相关。为了检测GFAP-Cre；LRP4f/f老鼠的易释放池是否异常,我们采用电生理的方法,即用0,5摩尔浓度的蔗糖去喷射富含突触区域,此法已证明能同时释放所有易释放池里的囊泡,并且是钙离子非依赖的。测量结果证明GFAP-Cre；LRP4f/f老鼠海马内的易释放池并未发生变化(P=0.624)。以上结果暗示了丢失的LRP4蛋白通过未知的信号调节了突触前的递质释放。因为缺乏有效的LRP4染色抗体,我们不能直接从染色方面获得LRP4表达情况的信息。因此,我们构建了几种不同Cre驱动的条件敲除老鼠。NEX-Cre和Camk2α-Cre已证明是兴奋性神经元特异性表达的cre系列。当它们与LRP4f/f老鼠交配后,后代的大脑兴奋性神经元里的LRP4即被敲除。有趣的是,免疫印迹结果显示海马里LRP4蛋白表达量并没有发生变化,暗示LRP4并不在兴奋性神经元里表达或者表达很少。功能上,我们检测了对PTZ诱导癫痫的反应程度,以及sEPSC和Paired-pulse ratios,都没有发现明显的变化(PTZ:P=0.858；sEPSC:P=0.942；ratioP=0.740),进一步证明了兴奋性神经元里的LRP4对神经元活性的调解并无功能或者LRP4根本就不表达在兴奋性神经元上。相似的方法,我们构建了在表达Parvalbumin(PV)蛋白的中间神经元的LRP4敲除老鼠,免疫印迹以及功能测试都没有发现阳性结果(PTZ:P=0.65；sEPSC:P=0.589；ratio:0.342).这些结果证明表达在神经元上的LRP4蛋白并不是必要的,而且暗示了表达在胶质细胞上的LRP4具有关键的功能。为了验证这个假说,我们设计了共同培养实验。来自于GFAP-Cre;LRP4f/f胚胎的神经元和1到3天幼崽的星形胶质细胞分别离体培养。独立生长到11天的神经元与星形胶质细胞非接触式的共同培养,一天后我们记录神经元的sEPSC.结果发现当来自于对照老鼠的神经元与GFAP-Cre；LRP4f/f的胶质细胞共培养后,sEPSC的发放频率与都来自于对照组的共培养的神经元比较降低了(P=0.007),幅度并没有变化(P=0.331)。相反,当GFAP-Cre； LRP4f/f的神经元和对照组星形胶质细胞共培养后,sEPSC的频率并没有发生变化(P=0.516),提示了失去LRP4的星形胶质细胞对神经元的活动有抑制作用,也再一次证明了神经元上的LRP4是非必要的。无悬念的,同时来自于GFAP-Cre:LRP4f/,f老鼠神经元和星形胶质细胞共培养后,神经元的sEPSC频率也降低了(P=0.004)。以上实验结果证明了表达在星形胶质细胞上而非神经元上的LRP4对神经元活动的调解起着重要的作用。综上所述,我们的实验结果表明,agrin通过作用于星形胶质细胞上的LRP4蛋白,抑制了星形胶质细胞ATP的释放,兴奋性神经元的活动因胞外低浓度的腺苷得到了增强。我们第一次报道了LRP4蛋白的特异性表达以及Agrin-LRP4信号通路在大脑里的新功能,为神经元和胶质细胞之间相互联系提供了新的机制。