实验背景:白血病治疗的目标是通过化疗使患者达完全缓解;再通过化疗或者造血干细胞移植的方法力争取得患者长期无病生存或痊愈;早期预测复发并及时治疗。近年来,由于新的化疗药物的出现和骨髓移植的发展,白血病的完全缓解率已明显上升,但早期预测复发是亟待解决的问题。因为经诱导缓解治疗达CR 时体内白血病细胞仅降至108~109,占细胞总数的1/1000~10000,目前实验室常用的方法不能将其检测出,所以研究新的检测方法是目前白血病诊断领域的热点课题。实验目的:1.建立实时定量RT-PCR反应体系,为白血病的诊断及进一步检测MRD 提供证据:2.绘制BCR-ABL 融合基因定量PCR 反应的标准曲线;3.定量检测慢性粒细胞白血病患者初治时BCR-ABLmRNA 水平。实验方法:RT-PCR 扩增K562 细胞BCR-ABL 融合基因;T-A克隆法构建重组质粒做为标准拷贝浓度的模板;应用ABI Prism 7000 型定量检测仪建立定量PCR 的方法,绘制BCR-ABL 融合基因的标准曲线;标定反应的灵敏度、稳定性和重复性。结果:该法可检测出10 个拷贝浓度的重组质粒;重复性及稳定性测定Ct 值变异系数分别为2.19%和3.21%;16 例慢粒患者BCR-ABL 表达量中位数为4.58×104kb/μg RNA。结论:应用Taqman 技术成功的建立了实时定量PCR 方法,并验证了方法的稳定性和重复性。2. 已建立的实时定量PCR 方法能检测b2a2 和b3a2 两种慢性粒细胞白血病融合基因型,可作为慢性粒细胞白血病的诊断方法。3. 定量检测10 个拷贝浓度的重组质粒,可定量分析BCR-ABL 融合基因,判定慢性粒细胞白血病预后,及早预测复发; 4. 与普通PCR 相比,不仅可以定量,更可检测出后者不能检测到的结果,可用于MRD 的检测。