细胞色素P450（cytochrome P450，简称CYP）是生物体内广泛参与内源性物质和外源性化合物代谢的代谢酶系，由多种同工酶构成。肝脏含有丰富的细胞色素P450，是动物重要的生物转化场所，因此肝微粒体经常被用来进行体外的药物代谢研究。在人体内，CYP3A4代谢50％以上的临床药物。研究揭示，对人类肝脏含量最高、也是代谢药物最多的CYP3A亚族，其最合适的动物模型是猪。药物代谢的体外和体内研究数据有一定的相关性，结合体内外的研究，可用于评价药物在动物体内的代谢情况。　　 T-2毒素是镰刀菌属真菌的一种代谢产物，是隶属单端孢霉烯族毒素中毒性最强的一种毒素。该毒素广泛存在于粮食作物及其半成品中，是危险的食品污染物，对人畜健康危害十分严重。本实验室前期研究提示，在T-2毒素的生物转化过程中，CYP3A22可能发挥着十分重要的解毒功能。为此，本实验通过体外重组CYP3A22酶催化体系，检测其催化T-2毒素代谢的产物，从而进一步阐明T-2毒素的代谢机制及CYP在外源化合物代谢中所起的关键作用。本论文具体研究如下：　　 1.免疫印记鉴定猪肝微粒体中CYP3A亚族的存在　　 差速离心法制备猪肝微粒体，Bradford法测定蛋白浓度，用CYP3A rabbitpolyclonalIgG进行蛋白质免疫印记鉴定。结果显示：猪肝微粒体中含有与人CYP3A亚族相类似的CYP3A亚族存在，分子大小约为52KDa。结果表明，猪肝微粒体可用于体外CYP3A药物代谢的研究。　　 2.猪肝微粒体中CYP3A亚族酶动力学的测定及抑制动力学研究　　 用人CYP3A4的模式底物nifedipine充当猪CYP3A亚族的酶催化底物，用人CYP3A4的特异性抑制剂ketoconazole来分析其对CYP3A亚族催化nifedipine氧化能力的影响，利用HPLC检测氧化产物oxidized nifedipine的量来分析CYP3A的酶动力学参数。结果显示：猪肝微粒体中CYP3A亚族的酶动力学参数Km和Vmax的值分别为97.5±5.5μM和1.173±0.0187nmolmin-1mg-1protein;ketoconazole抑制猪肝微粒体中CYP3A酶催化反应的IC50为0.29μM;在整个体系中加入0.5μMketoconazole，猪肝微粒体中CYP3A亚族的酶动力学参数K，,和Vmax的值分别为106.4±10.85μM和0.553±0.0165nmolmin-1mg-1protein，而且ketoconazole对猪CYP3A的抑制作用不因时间而减弱。结果表明：猪肝微粒体中CYP3A的酶动力学参数与其他研究报道的人CYP3A的酶动力学参数相吻合；ketoconazole以非竞争性的模式强烈抑制猪CYP3A亚族的活性。　　 3.CYP3A22重组蛋白酶活性分析　　 构建pET28a-CYP3A22-N-33原核表达载体，再通过大肠杆菌表达，经过镍柱纯化得到一定纯度的CYP3A22重组蛋白，再通过体外重构CYP3A22酶催化体系，以nifedipine为底物、ketoconazole为抑制剂分析CYP3A22重组蛋白的酶活性。结果显示，CYP3A22重组蛋白不但具有类似CYP3A4催化nifedipine氧化的功能，也类似CYP3A4一样被ketoconazole抑制其活性。结果表明：在猪体内，CYP3A22可能具有人CYP3A4的功能，参与多种药物或其它外源性化合物的转化。　　 4.CYP3A22在T-2毒素生物转化过程中的功能研究　　 利用CYP3A22体外重组的酶催化体系对T-2毒素和HT-2毒素进行孵育，并利用ketoconazole作为抑制剂，通过LC-MS/MS检测T-2毒素和HT-2毒素的代谢产物。结果发现：CYP3A22能够催化T-2毒素和HT-2毒素分子上C-3位置的羟化反应，生成毒性较弱的3-OH-T-2和3-OH-HT-2，同时这个反应可以被ketoconazole抑制。结果显示：CYP3A22是T-2毒素和HT-2毒素生物转化过程中的一种关键代谢酶。　　 结论：本研究成功建立了猪肝微粒体药物代谢研究平台，阐明猪CYP3A22在T-2毒素生物转化过程中关键代谢酶的地位，为进一步深入了解猪CYP3A亚族的酶学特性、催化药物代谢的种类及代谢机制打下基础，也为进一步了解T-2毒素在猪体内的催化代谢机制以及毒理学研究提供理论依据。