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研究背景与目的:非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是世界上最常见的恶性肿瘤,总的5年生存率仅15%,已成为恶性肿瘤首位死亡原因。近年来小分子靶向药物的发展,对NSCLC的治疗产生了重大影响。然而,由于靶点局限性及耐药性等问题,大多数NSCLC病人并没有合适靶向药物可选用。为改变NSCLC的治疗现状,迫切需要寻找新的治疗靶点。神经囊泡膜蛋白Neurensin-2(NRSN2)是新近发现的基因,编码一种多通道囊泡膜蛋白,主要参与囊泡运输和神经信号传导。针对NRSN2的以往研究主要集中在神经信号传导。近年研究显示NRSN2表达异常与肿瘤发生有关。有趣的是,在肝癌和恶性黑色素瘤的研究中发现,NRSN2承担着截然相反的功能——抑癌和或促癌。我们在检索Oncomine数据库(基因芯片数据库)中发现NRSN2在NSCLC呈中高表达。研究也表明NSCLC(尤其是肺腺癌)与神经内分泌失调紧密相关。因此,我们推测NRSN2可能与NSCLC密切关联。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/m TOR)信号转导通路是重要的细胞内信号传导通路,它的功能主要是促进细胞的增殖和抗凋亡。PI3K/AKT/m TOR通路的异常激活是NSCLC发生和发展的重要机制,而NRSN2是否参与了PI3K/AKT/m TOR通路的激活还不完全清楚。本研究主要通过过表达或si RNA抑制等方法,探讨NRSN2在NSCLC增殖、侵袭中的作用及分子机制,旨为寻找治疗NSCLC新靶点和研发靶向药物提供理论依据。方法:(1)采用荧光定量PCR、免疫组化染色、免疫印迹等方法分别从m RNA及蛋白水平检测NRSN2在NSCLC组织中的表达。统计分析NRSN2表达与NSCLC各临床病理因素间的关系。(2)采用基因重组的方法,利用慢病毒载体构建稳定表达NRSN2基因的真核细胞载体以及RNAi技术沉默NRSN2基因表达。通过转染A549肺癌细胞株,分别建立NRSN2过表达及低表达(沉默)的肺癌细胞模型。(3)CCK-8法、平板克隆实验、Transwell小室侵袭实验研究过表达和抑制NRSN2基因表达对A549肺癌细胞的生长、侵袭等生物学行为的影响。(4)免疫印迹检测研究NRSN2基因过表达和基因沉默后PI3K/AKT/m TOR通路主要成员AKT及m TOR的磷酸化水平。结果:(1)NRSN2在NSCLC组织中表达升高,且表达水平与肿瘤大小及分化显著正相关与正常肺组织相比,NRSN2在NSCLC组织中表达显著升高(p<0.01)。免疫化染色提示NRSN2蛋白表达阳性率与肿瘤大小及肿瘤分化密切相关(p<0.05),但与患者性别、年龄、病理类型、TNM分期等其他临床病理特征无关。(2)沉默NRSN2表达抑制A549肺癌细胞活性及增殖能力采用RNA干扰沉默A549肺癌细胞中NRSN2基因表达。采用CCK-8检测si-NRSN2组与si-NC组细胞活性,结果显示,相比si-NC组si-NRSN2组细胞活性显著减弱(p<0.01)。平板克隆形成实验也揭示,相比对照组,si-NRSN2组的细胞克隆形成率也显著减弱(p<0.01)。(3)NRSN2过表达提高A549肺癌细胞活性,促进癌细胞增殖利用慢病毒载体构建NRSN2基因的真核细胞载体感染A549细胞,成功建立稳定过表达NRSN2的A549肺癌细胞系。与空载慢病毒质粒感染组(lenti-vector)相比较含NRSN2基因片段的重组慢病毒质粒感染A549细胞组(lenti-NRSN2),CCK-8法细胞活性检测显示,lenti-NRSN2组A549细胞活性显著提高(p<0.01)。平板克隆形成实验也揭示与lenti-vector组相比,过表达NRSN2的细胞克隆形成率显著升高(p<0.01)。(4)NRSN2表达水平与肺癌细胞侵袭能力无关Transwell小室迁移实验研究结果发现,外源性增加NRSN2表达或沉默NRSN2表达,A549肺癌细胞侵袭能力无改变。(5)NRSN2可能活化PI3K/AKT/m TOR信号通路促进肺癌细胞生长提取各组A549细胞的总蛋白进行免疫印迹实验分析。结果发现沉默NRSN2表达后,AKT及m TOR的磷酸化水平降低;反之,上调NRSN2表达,AKT及m TOR的磷酸化水平升高。结论:NSCLC组织中高水平表达的NRSN2可能激活PI3K/AKT/m TOR信号通路,促进NSCLC生长。研究验证了NRSN2具有促癌的功能。