论文部分内容阅读
[目的]溃疡性结肠炎是炎症性肠病的一个主要类型,属于结、直肠粘膜的弥漫性炎症。其临床特点为原因不明的反复血便。目前尚无一个可明确的病因以及相应有效的内科治疗方法。由于溃疡性结肠炎在临床诊断和治疗方面较为复杂,还没有很明确的直接有效的药物,世界卫生组织认为溃疡性结肠炎属于难治愈的疾病之一。深入研究溃疡性结肠炎发生的分子机制,寻找靶向治疗或者有效的临床缓解方案具有重要的临床意义。已有的研究表明自噬在结、直肠炎症中常常发生。而我们课题组前期的研究也发现HSF2在溃疡性结肠炎患者中高表达。二者之间是否有联系?是否能够提供靶向治疗的新思路?在本研究中,我们将对此做进一步验证。研究将初步探索二者在溃疡性结肠炎中的作用及可能的分子机制。[方法]1,收集诊断明确的溃疡性结肠炎患者肠黏膜组织标本50例,采用HE染色明确UC的特征性病理表现,免疫组化方法检测患者与30例正常对照组肠黏膜组织中HSF2的表达情况,分析与临床病例特征的关系。透射电镜观察各组组织中自噬泡和自噬小体的数量。通过荧光定量和Western blot方法检测自噬标志物LC3Ⅱ的表达水平。2,利用不同浓度的丁酸钠诱导HT29细胞自噬,观察HSF2的表达变化。构建HSF2过表达和shRNA干扰慢病毒,转染HT29细胞株,通过荧光定量PCR和Western blot技术检测慢病毒转染效率。转染HSF2干扰或者过表达慢病毒后,再用丁酸钠处理细胞,电镜观察各组细胞中自噬泡和自噬小体的数量。GFP-LC3转染实验检测自噬小体的数量。Western blot检测自噬标志物LC3Ⅱ、beclin1和p62的表达变化。3,丁酸钠诱导HT29细胞自噬,利用western blot方法检测内质网应激和insulin/IGF1信号通路中关键蛋白GRP78/BIP、PID、GRP94、mTOR及PI3K的表达水平,以及PI3K磷酸化水平。4,转染HSF2慢病毒后,使用丁酸钠处理HT29细胞。通过MTT检测HT29细胞的增殖能力；通过Transwell细胞小室实验评估细胞的侵袭能力；通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡；通过电镜及western blot检测过表达和干扰HSF2对上述过程中丁酸钠所引起的自噬变化。[结果]1,50例溃疡性结肠炎组织中HSF2的阳性表达率为62%(31/50),与30例正常对照组(30%,9/30)相比具有统计学差异。同时,透射电镜观察到溃疡性结肠炎组织较对照组出现相对较多的自噬泡和自噬小体。荧光定量PCR和western blot检测结果显示与正常对照组相比,UC组患者的HSF2 mRNA转录和表达水平升高,自噬标志物LC3II和beclin-1的表达也较正常组增高,而底物p62的表达显著降低。2,不同浓度的丁酸钠处理HT29细胞后,HSF2的表达水平与丁酸钠的浓度呈正相关,同时LC3II的蛋白表达水平也不断升高。5nM的丁酸钠能诱导细胞发生自噬。转染HSF2干扰慢病毒后,电镜下的自噬小体数量明显降低；免疫荧光显微镜显示GFP-LC3标记的自噬小体数也明显降低；同时丁酸钠诱导的自噬标志物LC3II和beclinl和p62的表达变化受到相反的拮抗作用。3,丁酸钠可以诱导并上调HT29细胞的GRP78/BIP表达,但对PID和GRP94的表达水平无影响；同时丁酸钠也能够上调IGF-1R和PI3K的表达,抑制mTOR的表达,诱导自噬；通过慢病毒转染干扰HT29细胞的HSF2表达后,GRP78/BIP的表达水平降低,PID和GRP94表达水平无变化；干扰HSF2,能够有效降低PI3K的表达水平,上调mTOR,降低自噬水平。然而,干扰HSF2表达并没有改变IGF-1R的变化,说明HSF2可能直接通过 PI3K/mTOR信号通路作用,而非经过IGF-1通路。4,2.5mmol/L以上浓度的丁酸钠可以抑制HT-29细胞增值并诱导凋亡,并呈时间、浓度依赖性；进一步过表达HSF2后,HT-29细胞在丁酸钠诱导凋亡环境下,过表达HSF2的细胞增值活性明显升高,但沉默HSF2的HT-29细胞增值活性明显下降；同时,过表达HSF2的HT-29细胞迁移率较未处理的细胞明显增高,而沉默HSF2的HT-29细胞的这种趋势减弱。过表达HSF2能拮抗丁酸钠的这些作用,增强丁酸钠诱导的HT-29细胞的自噬。过表达和沉默HSF2的HT-29凋亡和迁移实验结果提示HSF2对肠上皮细胞可能起到保护和受损修复作用。[结论]1.溃疡性结肠炎患者组织中HSF2高表达,同时,高表达HSF2的患者组织自噬水平较其他组别中显著提高,提示HSF2在溃疡性结肠炎的发病过程中可能起重要作用。2.丁酸钠能够诱导HT29细胞发生自噬,该自噬为HSF2依赖性。抑制HSF2的表达能够降低丁酸钠诱导的自噬水平。其机制可能与内质网应激和Insulin/IGF1信号通路相关。3.丁酸钠能够影响HT29细胞增殖、迁移和侵袭能力,并能促进细胞的凋亡。过表达HSF2能够拮抗丁酸钠的这些作用,同时能够增强丁酸钠诱导的自噬。这提示我们HSF2有可能成为溃疡性结肠炎中的一个治疗靶点。