结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是当代常见消化道恶性肿瘤之一。每年全球有约120万名患者被确诊为结直肠癌,而有超过60万名患者直接或间接死于结直肠癌。在我国,结直肠癌的发病率居常见肿瘤的第四位仅次于肺癌、胃癌及肝癌,也是我国肿瘤发病率上升最快的肿瘤之一。由于结直肠癌发生机制尚不完全明确,故在结肠癌的诊治方面仍存在困难,发病率、死亡率居高不下。目前,手术治疗是结直肠癌最有效的治疗方法,非手术治疗的方法主要有化疗、放疗、生物治疗以及分子靶向治疗。目前提倡个体化治疗,若无法手术治疗,则需行化疗、放疗。结直肠癌的疾病分期是最重要的预后因素。在我国,由于大部分患者被确诊时己属中晚期,术后超过1/3的患者出现复发转移,严重影响患者的生活质量、缩短生存期。因此高效筛查、早期诊断和复发的早期检测是提高结直肠癌的疗效和预后的关键,对提高患者生活质量、减轻痛苦,延长生命具有重要意义。研究显示,结直肠癌如能早期诊断、早期治疗是有机会治愈的。肿瘤标志物,又称肿瘤标记物(tumor marker,TM),是指特征性存在于恶性肿瘤细胞中,或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质,或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质。肿瘤患者的组织、体液和排泄物中都有肿瘤标志物的存在。检测它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质.并能反映肿瘤发生、发展,了解肿瘤的组织发生、发展、细胞分化程度及细胞的功能,协助肿瘤的诊断、分类分型、判断预后以及指导下一步治疗。肿瘤标志物是目前诊断结直肠癌的主要辅助手段之一。目前普遍使用的结直肠癌血清学诊断标志物是CEA、CA19-9、CA724、 CA125、CA242、CA50,作为目前广泛应用的血清学早期诊断标记物。其灵敏度及特异度都不高。由于肿瘤基因的复杂性,要发现一个灵敏度和特异性的均较高的肿瘤标志物极其困难。医学科研人员正在积极努力寻找即具有高度灵敏度、又具有高度特异性的肿瘤标记物来协助诊断结直肠癌,这是具有重要意义的研究。在疾病研究中,比较蛋白质组学发挥着重要的作用,它首先检测出一种肿瘤组织的全部蛋白质,并通过对疾病组及对照组的比较,发现疾病特异蛋白组,通过对差异蛋白质组学的分析,可以发现灵敏度较高和特异性较强的肿瘤标志物,有助于恶性肿瘤的早期发现、早期诊断及早期治疗。并对疾病发病机制、诊断、治疗研究和新药开发有重要意义。本研究通过采用二维色谱与质谱联用技术,对结直肠癌及癌旁组织蛋白进行分析鉴定,结果发现有24个差异蛋白。其中上调蛋白15个,下调蛋白9个。此结果与本实验室前期的试验结果一致。本实验室将对这24个差异蛋白逐一进行验证,此次研究只对原肌球蛋白4(Tropomyosin4, TPM4)蛋白进行验证。原肌球蛋白(TPM)是细肌丝中与肌动蛋白的结合蛋白,长为41nm,分子量为2×35KPa,由平行的两条多肽链组成α螺旋构型,每条TPM4都是首尾相连接而形成一条连续不间断的链同肌动蛋白在细肌丝结合。原肌球蛋白是是调节蛋白,它在肌肉收缩过程中起着很重要的作用,以大量异构体形式存在于各种真核细胞中。哺乳动物中的4个TPM基因已被确认,即TPM1、TPM2、TPM3、TPM4,至少可表达出20种TPM异构体。既往研究显示,不同的TPM基因突变分别可引起不同的疾病。目前对原肌球蛋白4(TPM4)的研究较少,主要集中在肿瘤与肌肉相关疾病。肿瘤方面主要局限在与乳腺癌转移的相关性研究及膀胱癌的相关性研究。TPM4在结直肠癌中表达、与结直肠癌发生、发展及转移的相关性研究鲜有报道。我们拟应用二维色谱、质谱联用技术、免疫组织化学,实时定量荧光PCR (Real-Time PCR)和RNAi的方法,来探讨TPM4的表达变化与结直肠癌发病之间的关系。第一部分：应用二维色谱、质谱联用技术对结直肠癌与癌旁组织进行差异蛋白质组学研究方法：1、收集23例TMN分期为Ⅲ期的结直肠癌病理分型为腺癌患者的癌组织及癌旁组织标本。2、标本总蛋白提取,蛋白浓度分析。3、制备标本蛋白水解多肽混合物。4、二维色谱与质谱联用分析,数据库检索。5、Western blot蛋白质免疫印迹实验。结果：1、通过质谱数据采集、整理,癌组织中获得846个蛋白的鉴定资料,癌旁组织中获得535个蛋白质的鉴定资料。2、通过差异蛋白质组学研究,发现显著差异蛋白24个,在肿瘤组织中15个蛋白上调表达,9个蛋白下调表达。3、Western blot结果显示TPM4蛋白在癌组织中表达明显高于癌旁组织。小结：1、成功应用二维色谱与质谱联用技术完成结直肠癌组织及癌旁组织蛋白组数据鉴定。2、通过差异蛋白质组学研究,发现显著差异蛋白24个,其中上调蛋白15个下调蛋白9个。其中TPM4蛋白经Western blot实验显示在癌组织中表达明显高于癌旁组织。第二部分结直肠癌组织中TPM4水平表达及临床意义方法：1、临床资料收集。2、通过免疫组化方法测定结直肠癌肿瘤组织中TPM4蛋白表达。结果：1、结直肠癌肿瘤组织中TPM4表达水平显著高于癌旁组织。2、结直肠癌TNM分期中,TPM4在Ⅰ期和Ⅱ期癌组织中与Ⅲ期和Ⅳ期表达水平无显著性差异(p>0.05)；3、TPM4在有淋巴结转移的结直肠癌组织与无淋巴结转移的结直肠癌组织中的表达水平无显著性差异(p>0.05)；4、TPM4在伴远处转移的结直肠癌组织与无远处转移的结直肠癌组织中的表达水平无显著性差异(p>0.05)；5、低分化结直肠癌组织中TPM4表达水平显著高于中分化、高分化结直肠癌(p<0.01)。6、TPM4在结肠癌组织及直肠癌组织中的表达水平无显著性差异(p>0.05);7、TPM4在结直肠癌组织中表达与肿瘤大小无显著性关联(p>0.05)。小结：1、结直肠癌肿瘤组织中TPM4表达水平显著升高。2、结直肠癌组织中TPM4蛋白表达水平与肿瘤分化程度有关,与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移及远处转移、肿瘤大小、位置、性别、年龄无关。第三部分：结直肠癌细胞系的选择、表达载体的构建及鉴定方法：1、TPM4蛋白在不同结直肠癌细胞系及正常结肠细胞系中的表达。2、TPM4siRNA表达载体的构建和质粒扩增。3、TPM4siRNA载体转染效率测定。结果：1、SW480细胞株中TPM4蛋白表达量最高。2、成功构建的TPM4siRNA表达载体,扩增质粒浓度正常。3、TPM4siRNA载体的转染效率符合要求。小结：1、成功从结直肠癌细胞株中筛选出TPM4高表达的SW480细胞株。2、本部分实验所需TPM4siRNA载体构建由santa cruz公司完成,成功利用脂质体介导法将重组质粒TPM4siRNA转染到结直肠癌细胞SW480,荧光显微镜观察,构建的TPM siRNA表达载体能够高效转染SW480细胞。第四部分：TPM4siRNA转染对人结肠癌细胞生物学行为的影响方法：1、TPM4siRNA对SW480细胞TPM4mRNA转录水平的影响。2、CCK-8检测TPM4siRNA载体转染后对SW480细胞活性的影响。3、TPM4siRNA载体转染后,SW480细胞光镜下形态改变及电镜下细胞亚显微结构的改变。4、TPM4siRNA载体转染后对SW480细胞凋亡的影响。结果：1、TPM4siRNA转染后SW480中TPM4mRNA表达量明显下降。2、在SW480细胞中转染TPM4siRNA载体后,对细胞会生长抑制不明显。从时间梯度图来看,在转染TPM4siRNA载体24h后,开始对细胞生长有明显的抑制作用,48h作用更为明显些。3、TPM4siRNA转染后SW480细胞的亚细胞结构发生改变。4、TPM4siRNA转染后SW480细胞凋亡指数明显升高。小结：1、TPM4siRNA转染能有效沉默TPM4mRNA的表达。2、干扰SW480细胞TPM4的表达能有效抑制结直肠癌细胞的增殖。3、干扰SW480细胞TPM4的表达能改变结直肠癌细胞的亚结构。4、干扰SW480细胞TPM4的表达可有效促进结直肠癌细胞的凋亡结论：1、本课题成功建立了TMN分期为Ⅲ期结直肠癌组织及癌旁组织的差异蛋白质谱,其中差异蛋白24个,上调蛋白15个,下调蛋白9个。TPM4蛋白经蛋白印迹实验证实在癌组织中表达明显高于癌旁组织。2、通过免疫组化测定组织中TPM4的含量发现结直肠癌肿瘤组织中TPM4水平显著高于癌旁组织,且其表达水平与肿瘤的分化程度有关。3、成功构建了沉默TPM4基因的表达载体,并成功、高效转染SW480细胞。4、TPM4siRNA干扰SW480细胞后其生物学行为发生了明显改变：SW480细胞中TPM4mRNA的表达减少；SW480细胞增殖受到抑制,凋亡增强。