纳豆激酶是纳豆杆菌在发酵过程中产生的一种丝氨酸蛋白酶,具有良好的纤溶酶活性。用微生物发酵的方法生产纳豆激酶是现代纳豆激酶生产中优先采用的方法,因此人们也高度重视纳豆激酶发酵用菌种的研究。本试验的目的是通过诱变育种的方法,得到一株在发酵时能够产生较高纳豆激酶酶活力的菌株。试验采用本实验室筛选和保藏的纳豆杆菌T-3菌株为出发菌株,选取紫外线、微波、超声波、亚硝基胍和亚硝基胍-超声波联合诱变的方法,通过单因素试验、多因素交叉组合试验、旋转组合试验设计的方法,研究各种诱变方法的适宜诱变条件,并通过诱变提高纳豆激酶生产菌株的产酶能力,选育出纳豆激酶高产菌株,为发酵法生产纳豆激酶提供优良菌种。1.紫外线照射方法诱变T-3纳豆杆菌诱变条件的研究。为了获得一株能够发酵生产高纳豆激酶活性的菌株,采用紫外线照射方法诱变T-3纳豆杆菌,以T-3纳豆杆菌为出发菌株,研究不同的紫外线照射时间对诱变效果的影响。通过单因素试验确定紫外线诱变的时间,之后对T-3纳豆杆菌进行诱变处理。试验结果表明:240 s为紫外线诱变时适合的照射时间,经过诱变处理、酪蛋白平板初筛和摇瓶复筛,得到紫外线诱变后的突变株U2-5,其发酵生产纳豆激酶的酶活力可达到5440.37 IU/mL,比原始菌株提高8.8 %,并且遗传性能稳定。2.微波辐射方法诱变T-3纳豆杆菌诱变条件的研究。以T-3纳豆杆菌为出发菌株,通过单因素试验,研究不同的微波处理功率和不同的微波处理时间条件下微波处理对T-3纳豆杆菌诱变的效果,从而确定微波处理的时间和功率。在已经确定的微波诱变时间的条件下,对T-3纳豆杆菌进行诱变处理,运用酪蛋白平板初筛和摇瓶发酵复筛的方法,筛选出微波辐射诱变后的突变株。试验结果表明:微波诱变的处理功率为380 W,加热累计时间40 s,经过诱变和筛选获得突变株W2-1菌株,其发酵生产得到纳豆激酶活力为5450.00 IU/mL,比原始菌株提高9 %,并且遗传性能稳定。3.超声波处理方法诱变T-3纳豆杆菌诱变条件的研究。以T-3纳豆杆菌为出发菌株,通过单因素试验研究不同的超声波功率、频率、时间条件下的超声波对T-3纳豆杆菌诱变的效果。在单因素试验的基础上,采用正交试验优化诱变条件,从而确定超声波处理的功率、频率和时间,并对T-3纳豆杆菌进行诱变处理,并运用酪蛋白平板初筛和摇瓶发酵复筛的方法,筛选出超声波辐射诱变后的突变株。试验结果表明:超声波处理的功率为220 W,累计作用时间25 min,频率70 KHz,对T-3纳豆杆菌进行两轮诱变和筛选获得突变株C2-1菌株,其发酵生产得到纳豆激酶活力为5585.35 IU/mL,比原始菌株提高11.7 %,并且遗传性能稳定。4.亚硝基胍处理方法诱变T-3纳豆杆菌诱变条件的研究。以T-3纳豆杆菌为出发菌株,通过单因素试验,研究在不同的亚硝基胍处理时间和处理浓度条件下亚硝基胍对T-3纳豆杆菌诱变的效果,从而确定亚硝基胍处理的时间和浓度,并对T-3纳豆杆菌进行诱变处理,运用酪蛋白平板初筛和摇瓶发酵复筛的方法,筛选出亚硝基胍诱变后的突变株。试验结果表明:通过单因素试验确定亚硝基胍处理时间20 min和亚硝基胍处理浓度0.3 mg/mL,对T-3纳豆杆菌进行两轮诱变和筛选获得突变株Y2-1菌株,其发酵生产得到纳豆激酶活力为5740.25 IU/mL,比原始菌株提高14.8 %。5.亚硝基胍-超声波联合诱变方法诱变T-3纳豆杆菌诱变条件的研究。以T-3纳豆杆菌为出发菌株,通过单因素试验研究不同的亚硝基胍浓度、联合诱变处理时间、处理频率条件下的诱变处理对T-3纳豆杆菌诱变的效果。在单因素试验的基础上,采用二次回归正交旋转组合试验设计,优化联合诱变T-3纳豆杆菌的诱变条件,并在优化后的诱变条件下,对T-3纳豆杆菌进行诱变处理,并运用酪蛋白平板初筛和摇瓶发酵复筛的方法,筛选出联合诱变后的突变株。试验结果表明:T-3纳豆杆菌的诱变条件为亚硝基胍浓度0.3 mg/mL,处理时间20 min,处理频率70 KHz,对T-3纳豆杆菌进行诱变处理,筛选出突变株F2-1,其产纳豆激酶活力6600.52 IU/mL,比原始菌株T-3提高了30.0 %。通过研究得出结论,紫外线、微波、超声波、亚硝基胍和亚硝基胍-超声波联合诱变这五种诱变方法均具有较好的诱变效果,其中,亚硝基胍-超声波联合诱变方法的效果最好,用这种诱变方法得到的突变株产纳豆激酶的活力最高为6600.52 IU/mL,优于其他单一诱变方法的诱变效果。