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随着人民经济水平的提高和饮食方式的改变,肝癌已成为一种非常普遍的恶性肿瘤疾病,其中原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)占所有肝癌的85%以上,而发生在中国的HCC病例占世界总量的一半以上,已对人们的身心健康和生活质量产生了严重影响。迄今为止,如何对HCC进行有效的预防和治疗,仍然是社会所关注的一个重要科学问题。因此,开展HCC早期诊断和治疗的相关研究具有重要意义和价值。作为HCC的模式细胞之一,HepG2细胞系的靶向调控已成为众多研究者开展HCC预防和治疗策略的基础。本论文应用课题组创新合成的多枝状金纳米海胆星(Multi-branched sea-urchin like gold nanostars,MSGNS)与Anti-Glypican 3抗体组装的纳米颗粒聚合体(MSGNS-aGPC3),探究HepG2细胞在其膜表面受体Glypican-3(GPC3)被持续活化下的应激效应,解释了基于GPC3受体通路引起HepG2细胞凋亡的机制。主要研究内容如下:(1)采用改良的种子介导生长法合成了一种具有细胞膜吸附性的MSGNS。通过透射电镜、紫外、纳米粒度等表征了MSGNS纳米材料在不同合成阶段的形貌和特性,并分析了MSGNS的生长机理。采用SH-PEG对MSGNS进行修饰,改善了该材料的稳定性和生物相容性,借助CCK-8测试了MSGNS-PEG的细胞毒性,发现MSGNS-PEG具有低细胞毒性。此改良方法与传统的金种子生长合成方案相比,时间更短,步骤更简便,且合成的多枝状金纳米颗粒无表面活性剂,利于材料的后期修饰和应用,为后续偶联Anti-GPC3抗体的实验奠定了基础。(2)基于MSGNS-aGPC3纳米聚合体在HepG2细胞膜上的吸附性研究其对HepG2细胞凋亡的影响。将MSGNS-PEG与Anti-GPC3抗体共孵育形成MSGNS-aGPC3,将MSGNS-PEG和MSGNS-aGPC3分别与HepG2细胞共培养进行GPC3受体应激凋亡研究。结果显示:相较于MSGNS-PEG,MSGNS-aGPC3可以长时间吸附于细胞膜上,持续刺激细胞膜表面受体GPC3。采用原位荧光观察发现,MSGNS-aGPC3刺激HepG2细胞72 h后,HepG2细胞大量凋亡。采用Western blotting技术分析MSGNS-aGPC3刺激下HepG2细胞Wnt/β-catenin信号通路上的β-catenin、Cyclin-D1、GPC3蛋白含量的变化,结果发现:在GPC3受体刺激下,β-catenin、Cyclin-D1、GPC3的表达相比对照组均显著性下降,且GPC3表达相比MSGNS-PEG组显著性下降。此结果表明,与MSGNS偶联的Anti-GPC3抗体保持了其完整的生物活性,且MSGNS-aGPC3通过下调HepG2细胞Wnt/β-catenin通路上β-catenin、Cyclin-D1、GPC3的表达诱发细胞凋亡。(3)为深入分析Wnt/β-catenin通路上GPC3受体应激引起HepG2细胞凋亡的机制,采用KYA1797K和WAY262611分别下调和上调Wnt/β-catenin通路的表达。在不同干预条件下将MSGNS-aGPC3与HepG2细胞共培养,通过对细胞内三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)含量、细胞活性氧含量(Reactive oxygen species,ROS)、Wnt/β-catenin通路上相关蛋白含量进行检测分析,探讨了在Wnt/β-catenin通路被活化或抑制的条件下,GPC3持续活化后的HepG2细胞蛋白变化和能量差异。结果发现在Wnt/β-catenin被阻断时,MSGNS-aGPC3刺激HepG2细胞后,其β-catenin表达显著下降,GPC3表达无显著性差异,ATP含量和ROS含量均显著性下降,推测当Wnt/β-catenin通路被阻断,GPC3受体应激信号不表达。继而采用流式细胞检测仪和CCK-8试剂盒检测Wnt/β-catenin通路被阻断时GPC3应激下HepG2细胞的凋亡情况,发现抑制刺激组和空白组的凋亡率无显著差异,此结果表明当Wnt/β-catenin通路被阻断后,继续刺激GPC3受体来调控HCC无法达到使肝癌细胞凋亡的效果。