利用染色体数目相同的红鲫(Carassius auratus red var.,2n=100)为母本,湘江野鲤(Cyprinus carpio L.,2n=100)为父本产生的属间杂交后代中,获得了两性可育的异源四倍体鲫鲤(F3)。在异源四倍体鲫鲤稳定产生二倍体配子的基础上,利用异源四倍体鲫鲤(4nAT)与相关二倍体鱼等进行倍间交配,获得了生长速度快、抗病力强具有明显养殖优势的三倍体鱼。四倍体、三倍体鱼的形成为不同倍性鱼的生物学比较提供了重要的生物学平台。Piwi基因和piRNA在控制动物性腺发育中起重要作用。通过不同倍性鱼Piwi基因和piRNA的比较研究,探讨了三倍体湘云鲫、二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤Piwi-piRNA信号通路的相同性和差异性。此外,鱼类性腺发育主要受下丘脑-垂体-性腺轴(HPG axis)为主的神经内分泌系统所调控。而三倍体湘云鲫的HPG轴表达紊乱,因此有必要将HPG轴对该信号通路的调控作用做深入研究。本研究为进一步了解三倍体湘云鲫的不育性和异源四倍体鲫鲤可育性的分子内分泌机制提供理论依据,同时也为探讨Piwi-piRNA在硬骨鱼类中对鱼类性腺发育和配子发生的分子机制提供参考。本研究首次比较分析了二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤Piwi基因及piRNA的表达差异,并研究了HPG轴相关激素对其的影响。主要内容如下：1.二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤Piwi基因cDNA的全序列克隆,包括Piwil-1和Piwil-2基因。系统进化树中所有的Piwi蛋白序列分为两大枝——Piwil-1和Piwil-2,如人中的Hiwi和Hili,非洲爪蟾中的Xiwi和Xili,斑马鱼中的Ziwi和Zili。这些cDNA全长序列所包含的开放阅读框翻译的蛋白都含有PAZ和PIWI两个典型的Piwi基因功能域。另外,在鱼类中仅仅发现有2个Piwi旁系同源基因,而在两栖类或者哺乳类中的3到4个Piwi基因。这可能与高等动物中复杂的功能调控有关。2.比较研究Piwi基因在不同倍性鲫鲤不同组织中的表达情况。Piwi基因在三种鱼中仅在精巢和卵巢中有表达,而在其它进行检测的组织中均无表达。三倍体湘云鲫的Piwil-1和Piwil-2基因的mRNA在精巢中的表达量在繁殖季节低于二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤。对于卵巢,三倍体湘云鲫的Piwil-1和Piwil-2基因的mRNA表达水平在繁殖均显著高于二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤。免疫组织化学的结果显示,Piwil-1和Piwil-2蛋白表达于早期的卵母细胞、滤泡细胞和颗粒细胞,另外在较成熟的卵细胞放射膜周边也有表达。3.HPG轴对Piwi-piRNA信号通路的调控。体内和体外实验均证实,hCG处理后,Piwil-1和Piwil-2基因表达下调。间接地说明LH对Piwi的表达有抑制作用。与此类似,体内和体外E2处理实验证明,E2对Piwil-1和Piwil-2基因表达有抑制作用。同时,在繁殖期,三倍体湘云鲫卵巢中LHR的表达量明显低于二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤。由此,可知三倍湘云鲫的LHR表达较其它鱼低,HPG信号通路不能正常表达,从而导致了下游的E2表达较低。因此,在繁殖季节,三倍体湘云鲫较低的E2不能正常抑制Piwi基因的表达,Piwi在三倍体湘云鲫中就表达异常,明显高于其它两种可育鱼类。4.通过克隆卵巢中的小RNA序列在二倍体红鲫中获得了61个piRNA,三倍体湘云鲫中获得了72个piRNA,异源四倍体鲫鲤中获得了66个piRNA o有7个piRNA序列在三种鱼中都同时获得。从NCBI网上数据库中下载了鲤鱼和鲫鱼的EST、GSS、Nucletide序列,并结合本研究室前期的红鲫和鲤鱼的肝脏转录组测序结果,构建了数据库,对克隆的piRNA序列进行来源分析。结果显示仅有12个piRNA比对到mRNA序列,但是比对到的基因功能广泛。例如,ikbkg基因在免疫功能里有重要作用,zp2.5是与卵子发育密切相关的基因, ttlllO是一种微管蛋白络氨酸连接酶,ttnb是肌肉纤维的组成部分,锌指蛋白zbtb48是转录因子。可以看出,这些基因功能广泛,在生命活动中有重要意义。5.不同倍性鲫鲤piRNA的表达差异分析及E2对其调控作用。7个piRNA中有5个在三倍体湘云鲫中其表达显著性高于二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤。这些结果证实,piRNA的表达量与Piwi基因的表达有一定的联系。piRNA的表达量也受HPG轴的终端因子E2的抑制。综上所述,在繁殖季节,可育的鱼类HPG轴相关因子表达活跃,抑制了piRNA的表达,从而解除了piRNA对其它性腺发育相关序列的抑制,最终导致了鱼类成功排卵。在不育的雌性三倍体湘云鲫中,卵巢中的LHR表达下调引起了Piwi-piRNA信号通路表达异常升高,从而导致了三倍体湘云鲫的不育。本研究深入了对新型非编码RNA——piRNA的了解,并论述了主要生殖调控轴对其产生的影响,为鱼类分子内分泌提供了数据。