重组疫苗E.coli LLO/OVA诱导小鼠树突状细胞活化及抗肿瘤T细胞免疫的研究

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恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一,但目前的临床治疗效果不令人满意。针对肿瘤患者普遍存在机体免疫反应水平低下的现象,研究者们试图通过免疫治疗来诱导机体的肿瘤特异性免疫反应,以抑制肿瘤生长、防止肿瘤复发和转移。近年来,将携带肿瘤抗原的疫苗用于肿瘤免疫治疗已成为国际上肿瘤治疗研究的热点。各种肿瘤疫苗的动物实验获得了良好的效果,部分疫苗的临床实验也取得了一定的疗效。免疫治疗将可能成为继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗手段。在肿瘤免疫治疗实验中,研究者们采用了各种肿瘤疫苗,如多肽疫苗、肿瘤细胞疫苗、基因疫苗(包括DNA、RNA、重组病毒疫苗和重组细菌疫苗等)以及树突状细胞疫苗等。在制备疫苗时可单独使用肿瘤抗原,或与细胞因子和免疫佐剂等合用以诱导机体更强的特异性细胞毒T细胞反应。将这些疫苗经皮下、肌肉、静脉、淋巴结或肿瘤内注射免疫患者,诱导患者体内树突状细胞活化并增强肿瘤抗原特异性免疫反应。目前肿瘤疫苗研究的核心问题是如何增强疫苗的免疫刺激活性以诱导机体更强的特异性抗肿瘤免疫。单纯使用肿瘤抗原常不能诱导机体产生足够强的抗肿瘤免疫,加入免疫佐剂则可明显增强疫苗的免疫效果。为了进一步提高疫苗的免疫刺激活性,本课题拟以非致病性大肠杆菌为载体,联合携带模型肿瘤抗原卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)和李斯特溶素O(Lysteriolysin O, LLO)基因片段,构建重组E.coli LLO/OVA,对该疫苗诱导小鼠树突状细胞活化并刺激T细胞免疫的机制进行研究。本实验选用LLO作为免疫佐剂,利用其穿孔素作用促OVA抗原从树突状细胞的吞噬溶酶体进入细胞浆,并经MHC-I类分子递呈给CD8+ T细胞,从而诱导较强抗肿瘤免疫。使用细菌作为抗原DNA载体的优点在于:(1)活的减毒疫苗诱导宿主机体内细胞因子和炎前介质的分泌,这些成分增强了宿主的早期天然免疫,创造了有利于目的抗原递呈的微环境;(2)细菌的胞壁成分和去甲基化DNA作为病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)提供了危险信号,该信号活化了抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)的病原识别受体。PAMP刺激APC产生炎前细胞因子并上调共刺激分子,启动了机体的天然免疫反应,同时也促进了树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟并移行至次级淋巴器官。PAMP作为免疫佐剂增强了机体针对特异抗原的免疫反应。研究证明细菌成分作为天然免疫佐剂,特别有益于细胞毒T细胞活化。本实验以E.coli OVA为对照,分别用E.coli LLO/OVA和E.coli OVA免疫小鼠,比较两种疫苗的抑瘤效果;并观察用YTS169.4抗体去除CD8+T细胞后,E.coli LLO/OVA免疫小鼠对黑色素瘤细胞B16-OVA攻击的免疫保护作用,了解CD8+ T细胞在抗肿瘤免疫中的作用;用E.coli LLO/OVA体外刺激小鼠骨髓树突状细胞(Bone marrow dendritic cell,BMDC),检测BMDC的活化成熟程度并进行BMDC的NF-κB信号转导通路、趋化因子及受体和细胞因子基因芯片杂交以及部分基因的RT-PCR检测,并测定了BMDC培养上清液内细胞因子含量,了解疫苗对树突状细胞的免疫刺激作用;用E.coli LLO/OVA免疫后小鼠脾脏的CD11c细胞体外刺激同源CD4+ T、CD4+ CD25- T或CD8+ T细胞,观察这些细胞的增殖及细胞因子分泌水平,并检测脾脏内OVA特异的CD8+ T细胞数量,阐明活化的树突状细胞对T细胞增殖及分泌细胞因子的刺激作用。主要实验结果与结论如下:1)我们分别将携带LLO和OVA基因片段的质粒成功地转染入非致病性大肠杆菌菌株MC4100。采用IPTG诱导了LLO和OVA在E.coli中表达。通过蛋白质电泳凝胶考马斯亮篮染色和Westernblot证实了E.coli LLO/OVA和E.coli OVA中LLO和OVA的表达。2)用E.coli LLO/OVA经皮下免疫小鼠3次后,小鼠机体对黑色素瘤B16-OVA的免疫保护及免疫抑制作用明显强于E.coli OVA免疫小鼠;去除CD+8 T细胞后,疫苗免疫诱导的肿瘤免疫保护作用明显减弱,证实CD+8 T细胞是E.coli LLO/OVA诱导机体产生的最主要的抗肿瘤效应细胞。3)分别用E.coli LLO/OVA和E.coli OVA体外刺激小鼠BMDC后,BMDC的TLR2、TLR4、TLR7和Card4受体被激活,并通过NF-κB信号通路上调一系列趋化因子及受体基因、细胞因子基因以及共刺激分子的表达。E.coli LLO/OVA较E.coli OVA能更快速地通过NF-κB信号通路活化BMDC,产生更高水平的CXCR4、IFN-γ和G-CSF。4)与E.coli OVA相比,E.coli LLO/OVA免疫小鼠的脾脏CD11c细胞刺激同源CD4+ T或CD4+CD25- T细胞增殖作用相似,但能刺激同源CD4+ T细胞分泌更高水平的IL-2;E.coli LLO/OVA免疫小鼠的脾脏CD11c细胞刺激同源CD8+ T细胞更明显增殖并分泌更高水平的IFN-γ。E.coli LLO/OVA免疫小鼠的脾脏OVA特异的CD8+ T细胞数量明显多于E.coli OVA免疫小鼠。以上实验结果证实,E.coli LLO/OVA较E.coli OVA免疫小鼠能诱导机体产生更强的抗肿瘤T细胞免疫,抑瘤效果更明显。E.coli LLO/OVA通过激活TLR2、TLR4、TLR7和Card4受体,诱导树突状细胞活化成熟并经NF-kB信号通路上调一系列趋化因子及受体基因、细胞因子基因以及共刺激分子表达;活化的DC(CD11c细胞)刺激同源CD4+ T、CD4+CD25- T和CD8+ T细胞增殖并分泌细胞因子IL-2及IFN-γ。E.coli LLO/OVA免疫诱导小鼠机体产生了更多的OVA特异性CD8+ T细胞。总之,联合携带免疫佐剂李斯特溶素LLO和肿瘤抗原OVA的重组E.coli LLO/OVA较单纯携带肿瘤抗原OVA的重组E.coli OVA诱导了小鼠机体更强的T细胞抗肿瘤免疫。E.coli LLO将有可能作为携带人体肿瘤抗原基因载体,用于人体肿瘤疫苗的研究。
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