LRR-RLK基因在杨树中的反义表达和分子鉴定

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富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶(LRR-RLKs)参与植物生长发育及环境应答反应的多种信号转导过程,在植物体的整个生命过程中发挥着重要功能。最近有研究表明,LRR-RLKs在植物分生组织的形态建成及细胞分化过程中也承担着关键的调控作用。本文结合生物信息学、比较基因组学等研究手段,首先在草本模式植物拟南芥找到4个与次生维管组织形态建成及分化相关的关键AtLRR-RLK基因(BAM1、BAM2、BAM3、PXY),再以这些基因编码的蛋白序列为基础在木本模式植物毛果杨数据库中进行查找,得到一些相似性程度较高的候选基因;通过构建系统进化树,筛选出4个与拟南芥相关基因同源的基因,分别命名为PtBAM1、PtBAM2、PtPXYa、PtPXYb;接着对基因结构、蛋白质的理化性质、保守结构域、信号肽、跨膜螺旋残基及拓扑结构、亚细胞定位等进行了理论分析,确定上述四种蛋白质均为位于细胞质膜的具有LRR-RLK典型结构的单次跨膜蛋白。最后通过构建热图谱确定这些功能候选基因在杨树中表达的时空特异性。鉴于林木的维管系统的发育调控机制比拟南芥更为复杂,为了确定这些基因在杨树中确切功能,本文利用Gateway技术构建PtBAM1_RNAi,PtBAM2_RNAi,PtPXYa&b_RNAi,PtBAM1&2_RNAi,PtBAM1&2+PtPXYa&B_RNAi五个RNAi表达载体,通过根癌农杆菌C58(pMP90)介导的方法对Populus tremula×P.alba的叶柄或不含腋芽的茎段进行遗传转化,获得具有潮霉素(10mg/L)抗性的再生转化苗。对每一种RNAi转化苗,用特异性引物进行全基因组PCR分子鉴定,分别获得37,40,28,18,23株独立转化子。对于上述每种RNAi类型,各取15-20株转基因杨树的顶芽提取总RNA,反转为cDNA后对目的基因进行半定量RT-PCR,结果发现,与野生型相比RNAi型杨树中目的基因的表达水平都受到不同程度的下调。为了研究基因的功能,本研究还需要借助显微镜切片技术,对上述RNAi杨树的顶芽分生组织,叶脉维管组织,茎维管系统等组织进行进一步观察,通过它们形态学的变化确定这些功能候选基因的功能。
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