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目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）俗称“老年痴呆”,是一种缓发的不可逆性的中枢神经系统退行性病变,常发生在老年时期,其发病机制复杂,目前仍缺乏有效的治疗方法。当前社会老年人口逐年增加,人口老龄化加剧,AD发病率逐年上升,为患者和护理人员造成了严重的负担。微生物、肠道和脑之间存在神经、体液和免疫途径双向通信系统,即微生物-肠-脑轴,参与调控胃肠道微生物稳态、大脑功能及机体行为。肠道菌群失调可通过调控代谢产物、免疫调节、介导神经内分泌改变促进AD的发生,最新研究表明肠道菌群能够影响小胶质细胞（Microglia,MG）介导的神经元免疫微环境影响学习记忆。氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide,TMAO）是厚壁菌门代谢终产物,肠道厚壁菌门微生物以磷脂酰胆碱、胆碱等为原料产生三甲胺,三甲胺再进入肝脏被氧化而生成TMAO。近些年来TMAO被认为与衰老相关的疾病有关联,特别是在AD的发展过程中,已有研究证明轻度认知障碍患者和AD患者脑脊液中TMAO水平升高,越来越多的证据表明,肠道微生物代谢物TMAO与AD发病机制有关。目前研究主要关注肠道菌群与学习记忆能力、AD典型病理改变的相关性,关于肠道菌群对MG介导神经元免疫微环境及对AD神经元可塑性的具体调控作用与机制,尚不明确。因此,本研究以厚壁菌门代谢产物TMAO介导AD发生为切入点,探究厚壁菌门代谢产物TMAO影响AD神经元可塑性的可能机制,并进一步阐明TMAO驱动MG线粒体动力学失衡促进MG-M1极化介导AD发生的调控机制。研究方法:1)动物水平:7月龄的C57 BL/6J小鼠随机分为4组,分为对照组（Ctrl组）、TMAO低剂量组（TMAO-L组）、TMAO中剂量组（TMAO-M组）、TMAO高剂量组（TMAO-H组）,分别以0.9%生理盐水,0.5%、1.0%、1.5%TMAO灌胃8周;以7月龄APP/PS1转基因小鼠为阳性对照组（APP/PS1组）,以0.9%生理盐水灌胃8周,并以TMAO生成抑制剂1.0%的3,3-二甲基-1-丁醇（3,3-Dimethyl-1-butanol,DMB）灌胃8周作为TMAO体内干预组（APP/PS1+DMB组）;各组小鼠均雌雄各半。Morris水迷宫实验、被动避暗实验、自主活动实验考察动物学习记忆能力;16S RNA测序对各组动物肠道菌群进行物种分析;透射电镜观察各组小鼠海马超微结构的变化;免疫荧光考察离子化钙结合衔接分子1（Ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1）和线粒体活性氧（Mitochondrial ROS,mt ROS）的表达水平;蛋白质印迹法（Western blot,WB）和实时荧光定量聚合酶链反应（Polymerase Chain Re action,PCR）检测小胶质细胞表型标志物、神经元可塑性和线粒体动力学相关蛋白的表达水平。2)细胞水平:分别以低（5 m M）、中（10 m M）、高（25 m M）三种浓度的TMAO处理BV2细胞,即TMAO-L、TMAO-M、TMAO-H组,同步设立LPS+IFN-γ组和Control组分别作为阳性对照（PC）和空白对照（CON）。WB、实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、流式细胞技术等方法检测小胶质细胞的M1/M2表型标志物的表达情况;条件培养考察MG表型变化对神经元影响;CCK8检测神经元细胞的生存率;WB和实时荧光定量PCR检测线粒体动力学相关蛋白的表达情况。3)统计分析:实验数据使用平均数±标准差表示,采用SPSS25.0软件分析,两组之间比较采用t检验,多组之间比较采用Ordinary One-way ANOVA和Repeated One Way ANOVA方式进行,以P＜0.05表示有显著性差异。结果:1)APP/PS1转基因小鼠肠道菌群中厚壁菌门显著升高,以DMB抑制TMAO生成后可改显著其学习记忆能力:小鼠肠道菌群16S RNA测序发现,APP/PS1转基因小鼠肠道菌群中厚壁菌门/拟杆菌门的比例显著升高,提示小鼠肠道菌群紊乱可能与学习记忆相关;进一步Morris水迷宫实验发现,以DMB抑制厚壁菌门主要代谢产物TMAO生成后,APP/PS1转基因小鼠定向航行实验中逃避潜伏期和潜伏距离均显著降低,空间探索实验中穿越次数和目标象限探索时间增加,而被动避暗实验潜伏期明显延长,错误次数减少;各组小鼠自主活动能力均无显著差异;提示DMB可显著改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍;厚壁菌门代谢产物TMAO可能是参与AD发生发展的关键代谢产物。2)TMAO可显著降低C57 BL/6J小鼠学习和记忆能力,并显著降低神经元可塑性:以不同浓度TMAO灌胃处理C57 BL/6J小鼠后,行为学实验发现,在定向航行实验中,与Ctrl组相比,TMAO-M及TMAO-H组动物逃避潜伏期和逃避潜伏距离均显著延长,与APP/PS1组小鼠相似;而空间探索实验中,与Ctrl组相比,三种剂量组TMAO处理后小鼠的平台穿越次数和目标象限探索时间均较Ctrl组显著减少,被动避暗实验中潜伏期显著减少,错误次数增加;这提示TMAO可显著降低C57 BL/6J小鼠学习和记忆能力;在透射电镜下进一步观察到TMAO处理后C57 BL/6J小鼠出现与APP/PS1转基因小鼠类似的海马中神经元突触结构损伤,突触间隙模糊不清等神经元突触可塑性降低表现,并伴有神经元可塑性蛋白MAP2、GAP43及Syn蛋白表达水平显著降低。3)TMAO促进MG-M1极化,继发神经元损伤:为了明确TMAO的神经毒性作用,进一步以25 m M TMAO单独处理神经元细胞,发现其生存率无明显改变,提示TMAO的神经毒性作用并非对神经元的直接作用。小胶质细胞活化后释放炎性因子、趋化因子等效应因子影响神经元免疫微环境,对神经元可塑性具有独特作用。TMAO处理后BV2细胞的条件培养液可显著降低SH-SY5Y细胞的生存率,提示TMAO可能通过影响MG介导的神经元微环境进而影响神经元存活,因此,我们进一步关注TMAO对小胶质细胞M1/M2表型的影响。结果发现,中、高剂量TMAO处理后,C57 BL/6J小鼠海马内MG-M1标记物IL-1β、i NOS表达水平显著增高,MG-M2标记物IL-10、Arg1表达降低;提示TMAO可能诱导MG-M1极化作用。而进一步细胞水平发现,三种剂量TMAO均可显著增高BV2细胞M1表型标志物IL-1β、TNFα、i NOS、CD86表达水平,并降低M2表型标志物IL-10、Arg1、CD206的表达水平;提示TMAO可诱导MGM1极化。4)TMAO促进小鼠脑内小胶质细胞线粒体动力学改变:为了进一步明确TMAO诱导MG-M1极化影响神经元命运的机制,我们考察了与MG功能密切相关的MG线粒体功能。首先大数据分析显示线粒体动力相关蛋白1（Dynaminrelated protein 1,Drp1）在AD患者海马中表达显著增加,而线粒体融合蛋白2（Mitofusin 2,Mfn2）表达显著降低。进一步在透射电镜下观察到TMAO处理后C57 BL/6J小鼠脑内小胶质细胞线粒体超微结构发生变化,线粒体分裂增加,数量增加;同时伴有MG活化标志物Iba1和mt ROS水平显著增高;进一步发现TMAO处理后C57 BL/6J小鼠海马中Drp1表达显著增高,而Mfn2显著降低;进一步细胞水平检测显示,TMAO处理BV2细胞后,高剂量组Drp1显著增高、Mfn2表达显著降低;进一步以Midivi-1干预线粒体动力学,发现Mdivi-1干预后可显著抑制TMAO诱导MG-M1极化,降低TMAO诱导增高的M1表型标志物IL-1β、TNFα、CD86表达,升高MG-M2表型标记物IL-10、Arg1、CD206表达;进一步发现Midivi-1干预可逆转TMAO诱导MG-M1极化继发的SH-SY5Y细胞生存率降低;以上结果提示TMAO诱导MG线粒体动力学失衡恶化MG介导的神经元微环境降低神经元生存率。结论:厚壁菌门代谢产物TMAO参与AD发生,并通过驱动MG线粒体动力学失衡促进MG-M1极化降低AD神经元可塑性。