【摘 要】
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目的:克隆Serratia sp.S2中的铬(Ⅵ)代谢蛋白编码基因ChrA、ChrT,构建原核表达载体并转化至E.coli BL21中。通过研究工程菌的铬(Ⅵ)代谢特性,探索ChrA和ChrT基因在Cr(Ⅵ)代谢过程中的功能及机制。方法:以Serratia sp.S2的DNA作模板,采用PCR扩增ChrA、ChrT基因,构建表达载体pET-28a(+)-ChrA、pET-28a(+)-ChrT、p
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目的:克隆Serratia sp.S2中的铬(Ⅵ)代谢蛋白编码基因ChrA、ChrT,构建原核表达载体并转化至E.coli BL21中。通过研究工程菌的铬(Ⅵ)代谢特性,探索ChrA和ChrT基因在Cr(Ⅵ)代谢过程中的功能及机制。方法:以Serratia sp.S2的DNA作模板,采用PCR扩增ChrA、ChrT基因,构建表达载体pET-28a(+)-ChrA、pET-28a(+)-ChrT、pET-28a(+)-ChrAT,并转化至E.coli BL21表达以构建工程菌。测定工程菌的Cr(Ⅵ)耐受、生长曲线、Cr(Ⅵ)还原、Cr分布、铬还原酶活性和胞内氧化应激反应,确定ChrA、ChrT、ChrAT工程菌的耐受和还原Cr(Ⅵ)能力。结果:通过基因重组技术,成功构建出ChrA、ChrT、ChrAT工程菌。对Cr(Ⅵ)的耐受能力依次为:Serratia sp.S2>ChrAT≈ChrA>ChrT>Control(P<0.05),各菌株对Cr(Ⅵ)整体还原能力:Serratia sp.S2>ChrAT≈ChrT>ChrA(P<0.05)。通过铬分布实验确证Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)是两种主要存在价态,Cr(Ⅵ)还原过程涉及的电子供体对Chr(A)T工程菌铬还原酶活性的影响:NADPH>NADH>无NAD(P)H(P<0.05),在含有NAD(P)H的反应体系中,其酶活性显著上升(P<0.05)。在含Cr(Ⅵ)条件下,ChrA、ChrAT工程菌的Glutathione和NPSH水平均明显上升(P<0.05),而ChrT工程菌的指标含量变化并无统计学差异(P>0.05)。结论:ChrAT工程菌同时具备较强的耐受Cr(Ⅵ)和还原Cr(Ⅵ)能力,其主要是通过利用电子供体NADPH,以ChrT蛋白为辅酶,将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)。该还原过程促使胞内产生GSH、GSSG和NPSH等物质维持胞内还原状态,进一步提高ChrAT工程菌的Cr(Ⅵ)耐受和还原能力。
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