研究背景和目的结直肠癌是一种常见的、严重危害人类健康的消化系统恶性肿瘤。在我国常见恶性肿瘤死亡率排序中,结直肠癌在男性患者中占第四位,在女性患者中占第三位。近二十年来随着人们饮食构成及生活习惯的改变,结直肠癌发病率在逐渐增加,同时,其发病年龄明显提前,其中30-40岁的中青年发病比例上升最快。虽然近年来结直肠癌诊断和治疗水平已有很大提高,但死亡率仍然没有明显下降,其中转移是影响患者治疗效果、预后,导致死亡的关键所在。因此积极探讨与结直肠癌转移相关的因素,开展结直肠癌转移机制的研究,从而找到有效地预防和治疗方法,是结直肠癌研究的一项迫切任务,对当代肿瘤学具有十分重要的现实意义。随着分子生物学研究的进展,尤其是基因芯片技术的应用,目前已经明确许多与结直肠癌转移相关的分了标志物。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tlymphoma invasion and metastasis, Tiaml)就是本实验室早期利用自行研制的含有肿瘤转移相关基因cDNA芯片,结合文献轮廓挖掘微阵列表达数据的生物信息学方法,筛选出的一个与结直肠癌转移密切相关的新基因,并在结直肠癌中对其进行深入研究。Tiaml基因表达Tiaml蛋白,是一种常见的鸟苷酸转换因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs),属于Rho三磷酸鸟嘌呤核苷酸水解酶(GTPases)家族,可以特异性的激活Rac和Rho,通过参与Tiaml-Rac信号传递通路影响细胞骨架的组织、细胞粘附和运动,从而在肿瘤发生、侵袭和转移过程中发挥重要作用；Tiaml表达可以抑制转录因子c-myc,促进细胞增殖,抑制凋亡；Tiaml的表达可以调节粘附因子从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。研究表明,Tiaml在乳腺癌、肺癌、皮肤癌等肿瘤中具有明显的促肿瘤进展和转移作用,且这一效应与Tiaml表达量有明显的正相关性。本实验室前期研究结果也提示Tiaml在结直肠癌的进展过程中表达增高,在结直肠癌侵袭和转移过程中起重要作用,是结直肠癌的促癌、促转移相关基因。但是关于Tiaml在结直肠癌中表达升高的调控机制目前还不清楚。因此深入研究探讨Tiaml表达调控机制,从中找到可以抑制Tiaml表达的方法,进而抑制该基因在结直肠癌中促癌促转移作用,将有助于进一步明确Tiaml基因对结直肠癌发生、进展及转移的影响,并为结直肠癌的诊断和治疗提供新理论、新途径。基因的表达改变主要受遗传学改变和／或表观遗传学改变两种机制的调控。表观遗传学是指基因在核苷酸序列不发生改变的情况下,表达发生了可遗传的变化,并最终导致了表型的改变。这是一个可逆的化学修饰过程,属于遗传学的一门分支学科。DNA甲基化是表观遗传学中非常重要的一种机制,与基因表达抑制、基因功能缺失有关,目前对其的研究也最为深入。高水平表达的基因(如管家基因)趋向于低甲基化,而低表达的基因往往是高甲基化。异常甲基化在肿瘤中极为常见,致癌基因多发生低甲基化,导致其表达开放或表达升高；而抑癌基因的CpG岛高甲基化可导致其表达沉默,使其抑制肿瘤的活性丧失。近年来研究显示,与正常细胞相比,肿瘤细胞中普遍存在着基因组DNA整体低甲基化和局部CpG岛高甲基化的特点。一方面,基因组低甲基化会导致整个基因组的不稳定性增加,可导致癌基因或相关因子大量表达；另一方面,当CpG岛过度甲基化则会导致抑癌基因表达下调或失活,进而促进肿瘤发生、发展。CpG岛在基因组内呈不连续分布,通常位于基因的启动子区域(promoter region),少数位于第一外显子区域,故又称5’CpG岛。因此5’端CpG岛异常甲基化是调控基因表达的一个重要机制；并且启动子区甲基化的CpG位点的密度与转录的抑制程度相关,其高密度甚至可以完全抑制转录。正是由于5’端CpG岛具有上述分布特征和调控机制,DNA甲基化的研究多集中在启动子区的CpG岛。综上所述,CpG岛发生高甲基化抑制基因表达；CpG岛发生去甲基化促进基因表达,尤其是活化促癌基因,在肿瘤的发生和进展过程中起着重要作用。最近几年,关于肿瘤中一些基因5’端CpG岛低甲基化与基因表达增高相关的研究逐渐受到重视,并发现有多个基因5’端CpG岛的甲基化与肿瘤的发生有关。例如:SNCG/BSCG-1(synuclcin-ganmal/breast cancer specific gene1)基因,MMP(matrix metalloproteinase)和S100P基因等,5’端CpG岛低甲基化导致相应基因的表达增高。并且这些基因因低甲基化而高表达之后对肿瘤的发生发展起着明显的促进作用。我们通过生物信息学分析发现,Tiaml基因5’端存在一个长2183bp、含有256个CpG位点的CpG岛,跨越启动子和第一外显子。这些CpG位点发生异常甲基化将会影响该基因的表达。我们前期采用甲基化特异性PCR法(methylation-specific PCR, MSP)检测了结直肠癌中Tiaml基因启动子的甲基化状态。研究结果显示,Tiaml基因启动子高甲基化抑制该基因的表达,Tiaml基因启动子低甲基化促进该基因的表达。与正常结直肠粘膜组织相比,结直肠癌组织中Tiaml基因启动子甲基化程度下降,与其高表达呈负相关性。Tiaml基因启动子去甲基化后则使结直肠癌细胞学中该基因mRNA及蛋白表达明显升高。因此,我们前期的研究结果提示,Tiaml基因启动子异常甲基化是结直肠癌中Tiaml基因表达改变的一个重要调控机制。在本研究中,我们将进一步明确Tiaml基因启动子的异常甲基化在结直肠癌Tiaml基因表达调控中的作用、对结直肠细胞生长与侵袭能力的影响,以及DNA高甲基化对结直肠癌细胞生物学行为的影响。方法1结直肠癌组织和细胞系中Tiaml基因启动子的甲基化状态提取4例结直肠癌组织及其配对的正常结直肠黏膜组织,以及2株结直肠癌细胞株(SW620、SW480)中的基因组,采用亚硫酸氢盐修饰后测序法(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)检测Tiaml基因启动子甲基化情况；同时采用免疫组化法检测上述标本中Tiaml蛋白的表达情况。2Tiaml基因启动子甲基化对结直肠癌细胞生物学行为的影响以人类正常直肠组织的DNA为模板,采用PCR扩增得到未甲基化的Tiaml启动子(UP)；采用M.SssI甲基化酶处理Tiaml启动子的PCR产物,从而改变Tiaml启动子甲基化状态,得到高甲基化的Tiaml启动子(MP)。用BSP检测验证处理结果。将处理前后得到的未甲基化启动子和高甲基化启动子分别与PGL3.0-Basic载体相连,构建Tiaml甲基化启动子载体和未甲基化启动子载体,瞬时转染进结直肠癌细胞株HT29、LS174T、SW480中,用双荧光素酶报告测试系统检测甲基化前后启动子活性变化(细胞转染PGL3.0-Basic空载体用做空白对照组,mock)。将3800bp的Tiaml基因插入之前构建的启动子载体,构建成含有Tiaml启动子和Tiaml基因的新载体,分别瞬时转染进结直肠癌细胞株HT29、LS174T、SW480中,采用Q-PCR、免疫印记(Western Blot)、MTT、体外细胞Transwell小室侵袭实验和平板克隆形成实验,观察Tiaml基因启动子甲基化前后,Tiaml基因在1nRNA表达水平和蛋白表达水平的改变,以及结直肠癌细胞体外生长、侵袭和形成克隆能力的变化。3DNA高甲基化对体外结直肠癌细胞生物学行为的影响。实验室存有已制备好的稳定表达绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的结肠癌细胞株SW480/EGFP。采用MTT、体外细胞Transwell小室迁移、Transwell小室侵袭和平板克隆形成实验检测SW480/EGFP细胞与不带有荧光蛋白的SW480细胞体外生物学行为是否有差异,从而判断EGFP对SW480细胞生物学行为方面是否有影响。然后将SW480/EGFP细胞分为三组：分别用含有浓度为100μmol／L的S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-1-methionine, SAM)、S-腺苷高半胱氨酸(S-Adenosyl-L-homocysteine, SAH)、PBS的1640培养基处理细胞,隔天换液,连续处理6天。SAM作为中间代谢物,广泛存在于各种生物体内,参与诸多生化反应；SAM是最为常用的促甲基化药物,也是DNA甲基化的最主要的甲基供体。SAH为SAM的代谢产物,与SAM结构相似,但不具有甲基供体的功能,因而在本实验中用其作为药物对照。处理好的细胞用来进行体内外功能验证试验。采用BSP法检测Tiaml启动子甲基化情况；采用MTT、体外细胞Transwell小室迁移、Transwell小室侵袭和平板克隆形成实验来分析SAM药物处理对结直肠细胞中Tiaml基因DNA甲基化水平的影响和对结直肠癌细胞生物学行为的影响,明确DNA过甲基化对结直肠癌细胞体外生物学行为的影响。三组处理好的细胞,PBS作为空白对照组,SAH作为药物对照组,SAM作为药物处理组。4DNA甲基化对体内结直肠癌细胞生物学行为的影响。将上述三组处理好的细胞以2×106个肿瘤细胞／只的量注入裸鼠皮下,每组各五只裸鼠；另取这三组细胞,以3×106个肿瘤细胞／只的量经鼠尾静脉注射到裸鼠体内,每组各四只裸鼠。利用肿瘤细胞表达EGFP的特点,借助整体荧光体视镜结合IPP5.0软件采集、分析EGFP发出的荧光信号,在动物活体实时观察裸鼠皮下成瘤情况,应用病理学方法对肿瘤细胞的转移进行评价和鉴定。5统计学分析用SPSS13.0软件进行数据分析,细胞体外生长实验和裸鼠皮下成瘤实验采用析因方差检验。完全随机设计多样本均数比较的细胞体外Transwell小室迁移、Transwell小室侵袭及平板克隆形成实验结果,方差齐者,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验,多重比较采用LSD法；方差不齐者,采用近似F检验Welch法,多重比较采用DunnettT3法。完全随机设计两样本均数比较的细胞体外‘Transwell小室迁移、Trans well小室侵袭及平板克隆形成实验采用两样本t检验(independent-samples T test)。结果以P<0.05(two-tailed)认为差异有统计学意义。结果1结直肠癌中Tiaml启动子呈未甲基化状态,Tiam1蛋白高表达。亚硫酸氢盐修饰后测序法(Bisulfite Sequencing PCR, BSP)检测发现Tiaml基因启动子的CpG位点在结直肠癌组织、结直肠癌细胞株中均未甲基化,而在正常结直肠黏膜中发生了甲基化改变。说明Tiaml启动子区CpG岛在结直肠癌组织和细胞系中的甲基化水平显著低于配对的正常肠粘膜,即Tiaml启动子在结直肠癌组织和细胞系中发生了低甲基化或去甲基化改变。免疫组化检测结果表明：Tiaml蛋白在结直肠癌组织和细胞中表达,在正常肠粘膜中不表达,说明Tiaml在结直肠癌中高表达。上述研究结果提示,Tiaml在结直肠癌组织和细胞系中低表达,该启动子高甲基化；而在正常结直肠粘膜中高表达,该启动子低甲基化。Tiaml基因启动子的甲基化水平与其蛋白表达之间存在负相关性。2Tiaml启动子高甲基化抑制该基因的表达,并抑制结直肠癌细胞生物学行为未发生甲基化的Tiaml启动子经甲基化酶M.SssI处理后启动子发生甲基化；采用双荧光素酶报告测试系统检测甲基化前后启动子活性,结果表明甲基化前后启动子活性有差异(HT29：F=128.031,P<0.001；LS174T：F=128.031,P<0.001；SW480：F=91.243,P<0.001)。经LSD多重比较,甲基化的Tiaml启动子(MP)活性明显低于未甲基化的Tiaml启动子(UP)活性。表明DNA甲基化对Tiaml基因启动子活性具有抑制作用。Q-PCR检测结果显示,在结直肠癌细胞株中,与转染了未甲基化启动子(UP组)的细胞相比,在转染甲基化启动子(MP组)的细胞中,Tiaml基因mRNA表达水平明显下降,倍数值(Folds(UP:MP))分别为：7.032(HT29)、4.983(LS174T)和4.441(SW480)。Western blot结果显示,与UP组相比,转染空载体组(mock组)和MP组细胞中Tiaml蛋白表达水平均显著下降,mock组与MP组细胞中Tiaml蛋白表达水平无显著差异。提示结直肠癌细胞中,Tiaml启动子高甲基化后抑制了该基因的表达。MTT法绘制细胞的体外生长曲线,组间经近似F检验Welch法分析,结果表明,不同处理组间细胞体外生长能力有显著差异(HT29：F=249.347,P<0.001；LS174T.F=979.358,P<0.001；SW480：F=201.438,P<0.001)。Dunnett T3多重比较,结果表明,与UP组相比,mock组和MP组的结直肠癌细胞增殖速度显著减慢,而mock组与MP组结直肠癌细胞的增殖速度无显著差异；提示Tiaml基因启动子高甲基化后,抑制了结直肠癌细胞的生长增殖能力。Transwell小室侵袭实验证明,：nock组和MP组细胞穿过人工基底膜胶(ECMatrix)的细胞数少,细胞侵袭能力较弱；UP组细胞穿过ECMatrix的细胞数显著增多,细胞侵袭能力强,组间差异具有统计学意义(HT29：F=26.775,P<0.001;LS174T：F=110.031,P<0.001；SW480：F=31.553,P<0.001)；提示Tiaml基因启动子高甲基化后抑制了结直肠癌细胞的侵袭能力。平板克隆形成实验显示,mock组和MP组细胞克隆形成能力均明显低于UP组的细胞,组间差异具有统计学意义(HT29：F=14.887,P=0.005<0.05；LS174T：F=34.445,P=0.001<0.05;SW480：F=143.960,P<0.001)；提示Tiaml基因启动子高甲基化后抑制了结直肠癌细胞的平板克隆形成能力。我们上述研究结果表明,Tiaml基因启动子高甲基化后抑制了该基因及蛋白的表达,从而引起结直肠癌细胞生长增殖能力、侵袭能力以及平板克隆形成能力的抑制。因此Tiaml基因启动子的异常甲基化在Tiaml基因促进结直肠癌生长和侵袭中发挥了重要的作用。3SW480/EGFP+细胞与SW480细胞生物学行为能力无差异。MTT法绘制细胞的体外生长曲线,经析因方差分析,SW480/EGFP细胞与SW480细胞生长能力不具有显著差异(F=0.654,P=0.425>0.05)。结果说明EGFP对结直肠癌细胞株SW480体外生长能力没影响。Transwell小室运动实验证明,两组细胞运动迁移能力没有显著差异(t=0.447,P=0.667>0.05)。结果说明EGFP对结直肠癌细胞株SW480体外运动迁移能力没影响。Transwell小室侵袭实验证明,两组细胞侵袭能力没有显著差异(t=-0.221,P=0.831>0.05)。结果说明EGFP对结直肠癌细胞株SW480体外运动侵袭能力没影响。平板克隆形成实验显示,两组细胞克隆形成能力没有显著差异(t=0.508,P=0.638>0.05)。结果说明EGFP对结直肠癌细胞株SW480体外形成克隆能力没影响。4SAM对结直肠癌细胞在体外生物学行为的影响。BSP法检测PBS组、SAH处理组和SAM处理组细胞中Tiaml基因启动子甲基化状态,结果显示PBS组和SAH处理组的细胞中Tiaml基因启动子呈未甲基化状态；SAM处理组细胞中Tiaml基因启动子呈部分甲基化状态。揭示甲基化药物SAM可以诱导Tiaml基因发生高甲基化或过甲基化改变。MTT法绘制细胞的体外生长曲线,在PBS组、SAH处理组、SAM处理组之间比较,经析因方差分析得知,不同处理组间细胞生长存在显著差异,差异具有统计学意义(F=268.082,P<0.001)；经Dunnett T3多重比较,结果表明,与未处理组和SAH处理组细胞相比,经SAM处理的细胞增殖能力明显减慢,而PBS组和SAH处理组细胞的增殖速度无显著差异。Transwell小室运动实验证明,PBS组和SAH处理组细胞相体外迁移能力明显强于经SAM处理的细胞,SAM组与PBS组和SAH组之间差异具有统计学意义(F=56.139,P<0.001)Transwell小室侵袭实验揭示,与PBS组和SAH处理组细胞比较,经SAM处理的细胞的侵袭能力明显减弱,SAM组与PBS组和SAH组之间差异具有统计学意义(F=40.702,P<0.001)。平板克隆形成实验显示,与PBS组和SAH处理组细胞比较,经SAM处理的细胞克隆形成能力均明显减弱,SAM组与PBS组和SAH组之间差异具有统计学意义(F=175.233,P<0.001)。综上所述,我们的研究结果提示,SAM处理后可引起结直肠癌细胞生长能力、侵袭能力和平板克隆形成能力的改变,而Tiaml基因启动子高甲基化后表达的改变很可能在这其中起着重要的作用。5SAM对结直肠癌细胞在体内生物学行为的影响。构建甲基化相关的动物模型,我们观察了SAM对结直肠癌细胞株SW480/EGFP+皮下成瘤能力和在体内转移能力的影响。将上述经SAM、SAH、PBS处理过的三组结直肠癌细胞接种于裸鼠皮下,通过28天连续观察,不同处理组细胞间皮下成瘤能力差异显著(F=10.450,P<0.001)；经Dunnett T3多重比较发现, SAM组细胞皮下成瘤能力减弱,即细胞发生高甲基化后,显著地抑制了结直肠癌细胞皮下成瘤能力,各处理组皮下瘤体积从第7天开始有显著差异(F=6.542,P=0.012<0.05)：空白对照组与SAH处理组间皮下瘤生长能力始终无显著差异。采用尾静脉注射法将三组细胞分别注射入裸鼠体内,建立了整体可视化结直肠癌转移动物模型。在PBS组和SAH处理组,均有1／4裸鼠形成肺转移,而在SAM处理组,未发现裸鼠形成远处转移。结论1.促癌促转移相关基因Tiaml在结直肠癌中高表达,其启动子呈低甲基化改变。Tiaml基因启动子的异常甲基化是结直肠癌中Tiaml表达改变的重要调控机制。2. Tiaml基因启动子高甲基化抑制该基因的表达,并引起结直肠癌生长、迁移和侵袭能力的下降。Tiaml基因启动子的异常甲基化在Tiaml促进结直肠癌生长和迁移中发挥着重要的作用。3.高甲基化药物SAM具有抑制结直肠癌生长、迁移、侵袭和转移的作用,Tiaml基因启动子甲基化状态的改变及该基因表达的改变很可能参与了SAM引起的结直肠癌细胞生物学行为的变化。本研究的创新之处1明确了结直肠癌中Tiaml基因启动子呈低甲基化状态。2系统探讨了Tiaml启动子甲基化变化在Tiaml基因表达以及结直肠癌侵袭和转移中的作用3构建甲基化相关的整体可视化结直肠癌转移动物模型,为DNA异常甲基化在结直肠癌侵袭和转移中的作用提供新的研究手段。