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光合作用是地球上最重要的生物化学反应,它为几乎所有的生物提供生命活动所需的能量。植物光合作用主要在叶绿体中完成,而光能的吸收和传递又必须通过叶绿素来参与实现,所以对叶绿素合成与代谢的研究对于我们更好地认识光合作用进而提高作物产量等具有重大意义。叶绿素合成是四吡咯合成途径的一个分支,四吡咯广泛存在于生物体内,参与了生物体的各项活动。该途径由20多个基因编码的16种酶催化完成,研究这些基因的表达与调控网络,以及它们在其它生命活动中的潜在功能,将有助于更加深刻地认识叶绿素的合成和调控机制。 本论文针对四吡咯合成途径中的原卟啉原氧化酶PPO(ProtoporphyrinogenIX oxidase)进行了深入研究。发现拟南芥PPO由两个同工酶PPO1和PPO2组成,其中PPO1在植物体内具有广泛的表达且被光诱导;而PPO2的表达量却非常低,PPO2在功能上并不能替代PPO1。两者都定位于叶绿体中,其中PPO1在叶绿体基质和内囊体膜上均有分布。ppo1缺失突变体表现出幼苗黄化致死的表型,且叶绿体的发育受到阻碍,专一性地影响了叶绿素分支的合成。ppo1突变体中光系统蛋白的含量显著下降,其中NDH复合物的形成受到阻碍。PPO1参与了质体中18个RNA编辑位点的编辑,其中有15个位点位于NDH复合物的转录本上,且PPO1在体内能够结合到这些编辑位点附近的转录本上。通过酵母双杂交筛选,获得了PPO1的互作蛋白MORF2(Multiple organellar RNA editing factor2),体内体外的证据表明PPO1与质体定位的MORF家族蛋白都能相互作用,这种相互作用依赖于PPO1蛋白N端的22个氨基酸序列,而该序列两侧区域对于介导PPO1与MORF之间的相互作用至关重要,这些互作序列是PPO1发挥编辑功能及维持NDH复合物活性所必需的,但它们不影响PPO1的催化功能。序列比对分析表明这两段短肽只在植物中的PPO1中具有保守性。PPO1具有保守的辅酶FAD和底物结合结构域,序列比对发现在这两个结构域中含有三个保守的氨基酸基序,缺失突变分析表明这些保守基序对于PPO1发挥催化功能至关重要,但并不影响PPO1与MORF之间的相互作用,编辑功能及NDH复合物的稳定性。还发现MORF蛋白与多个参与特异位点编辑的PPR(pentatricopeptiderepeat)蛋白相互作用,因此,MORF因子起到连接PPO1和PPR蛋白的功能。 此外,ppo1-Ⅰ/+突变体的果荚明显短小皱缩并含有大量败育胚珠,花粉出现严重败育,正反交显示雌雄配子体的传递效率明显下降,DAPI染色表明在花粉有丝分裂的后期出现败育。酵母双杂交文库筛选发现,PPO1与一个未知功能的蛋白PPP1(PPO1-interacting protein involved in pollen development1)相互作用,体内和体外实验进一步证实了两者的互作。PPP1定位于质体,其基因在花粉中具有特异性的高表达。PPP1 amiRNA转基因植株也具有明显的花粉败育的表型。 本论文证明了PPO1催化叶绿素合成途径,发现它在质体RNA编辑和配子体发生过程中具有重要作用,意味着叶绿素合成酶的功能具有多样性,为其分子进化提供了见解。PPO1通过不同结构域与底物、辅酶或蛋白发生相互作用来参与植物生长发育的多个过程,为更好地理解叶绿素合成与光合作用调控提供了新的视角,也为利用遗传改良提高农作物的光合效率提供了理论依据。