[研究目的]脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemic reperfusion injury,CIRI)的病理机制非常复杂。脑缺血再灌注损伤大鼠中枢神经系统的保护作用与促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)介导的酪氨酸激酶 2(Janus family tyrosine kinases-2,JAK2)/信号传导与转录活化因子 3(signal transducers and activators of transcription-3,STAT3)细胞通路关系密切,是目前研究热点之一。本研究采用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞脑缺血再灌注模型,探讨电针百会、足三里穴对大鼠EPO介导的JAK2/STAT3信号转导通路、脑水肿和细胞凋亡的影响,为临床治疗缺血性脑血管病进一步提供实验依据。[研究方法]SPF级成年雄性SD大鼠36只,采用随机数字表法分为3组(每组12只):假手术组(S组)、模型组(M组)和电针百会、足三里组(EA组)。假手术组仅分离右侧颈总、颈内和颈外动脉,不插入线栓;模型组制作采用线栓法大脑中动脉脑缺血再灌注损伤模型,假手术组和模型组大鼠不干预,仅接受同电针组一样的抓取束缚刺激。电针组造模成功后取百会、左足三里穴电针干预,采用长城牌KWD-808II电针仪,疏密波、频率2-100 Hz、强度约2 mA,以肌肉收缩为度,时间为20min。电针组干预共2次。第一次干预在拔线栓后,第二次干预在处死前2h。模型组和电针组大鼠脑缺血2h再灌注,再灌注24h后麻醉处死。在脑缺血后2h及处死前采用Ludmila Belayev12分评分法检测各组大鼠运动、感觉完整性。处死前采用前肢踩空实验检测各组实验大鼠前肢对感觉及运动的整合能力,采用网屏实验评估各组大鼠前爪抓握能力及肌力情况。TTC染色检测各组大鼠脑梗死体积,HE染色检测缺血脑组织组织形态学的改变。免疫组化法检测大鼠脑组织EPO/EpoR,JAK2/STAT3以及AQP9的表达情况。免疫荧光双染法检测大鼠脑组织中JAK2和神经元,JAK2和星型胶质细胞共表达的情况。Western Blot和qPCR方法检测大鼠脑组织中EPO,EpoR,磷酸化的JAK2和STAT3,总的JAK2和STAT3以及水通道蛋白9(AQP9)mRNA和蛋白表达。原位末端标记(terminaldeoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling,Tunel)染色法检测脑组织中神经元凋亡的情况。免疫荧光法观察EPO+细胞和TUNEL+细胞共表达情况。[研究结果]1.电针百会、足三里穴对缺血脑组织组织形态学的影响TTC染色示模型组大鼠脑组织缺血区域变白,与周围正常鲜红脑组织形成对比。假手术组大鼠脑组织无明显白白色,电针组大鼠脑缺血程度较模型组轻。结果显示脑缺血区域集中在大脑中动脉供血区域(主要是皮质区和纹状体区)。HE染色示假手术组脑组织结构正常。模型组大鼠脑组织缺血区域组织疏松,细胞间隙变大,神经细胞肿胀,核仁模糊不清,甚至固缩或者消失。电针组大鼠脑组织缺血半暗带区域组织疏松程度较模型组程度轻,且固缩细胞核的细胞数量减少。2.电针百会、足三里穴对大鼠神经行为学的改变Ludmila Belayev12分评分法提示假手术组大鼠的神经功能评分正常。模型组大鼠Ludmila Belayev12评分最为严重。缺血2h的评分数值比缺血后24h的更高。2h模型组和电针组大鼠神经功能评分差别无统计学意义;24h时间点电针组大鼠神经功能评分明显低于模型组(P<0.05)。模型组和电针组大鼠的前肢踩空实验评分较假手术组明显升高,电针可以明显改善CIRI后大鼠的前肢踩空实验评分(P<0.05)。模型组和电针组大鼠的网屏实验评分较假手术组明显升高,电针可以明显改善脑缺血再灌注损伤CIRI后大鼠的网屏实验评分(P<0.05)。3.电针百会、足三里穴对大鼠EPO-JAK2/STAT3信号通路表达的影响免疫组化、Western Blot以及qPCR结果显示:与假手术组相比,模型组、电针组大鼠的EPO,EpoRmRNA和蛋白表达明显升高,差异显著(P<0.05),电针组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫组化,Western Blot以及qPCR结果显示:与假手术组相比,模型组、电针组大鼠的JAK2/STAT3mRNA和蛋白表达明显升高,差异显著(P<0.05),电针组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。Western Blot提示:与假手术组相比,模型组、电针组大鼠脑组织中有活性的 JAK2,STAT3(p-JAK2,p-STAT3)水平和总的 JAK2,STAT3 的比值p-JAK2/JAK2,p-STAT3/STAT3明显升高,差异显著(P<0.05),电针组与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。4.JAK2在脑组织中的细胞定位免疫荧光双染结果显示:脑组织缺血半暗带区域,JAK2阳性细胞趋于在NeuN阳性细胞中表达,而EPO阳性细胞和GFAP阳性细胞重合较少。提示JAK2主要在神经元表达,在星形胶质细胞中表达较少。5.电针百会、足三里穴对大鼠脑组织细胞凋亡的影响TUNEL染色提示:模型组大鼠脑组织中有大量凋亡细胞表达。与模型组相比,电针百会、足三里穴可以明显减少脑组织中凋亡细胞的数目。模型组大鼠脑组织TUNEL染色和EPO免疫荧光双染提示:脑组织中TUNEL阳性细胞和EPO阳性细胞趋于分离,提示脑缺血后对大鼠脑组织有保护作用的EPO表达增加,且对细胞凋亡具有抑制作用。6.电针百会、足三里穴对脑组织水肿相关蛋白AQP9的影响免疫组化、Western Blot以及qPCR结果显示:与假手术组相比,模型组、电针组大鼠的AQP9mRNA和蛋白表达明显升高,差异显著(P<0.05),电针组与模型组比较,可以明显降低脑组织中AQP9mRNA和蛋内表达水平(P<0.05)。[结论]1.电针百会、足三里穴可对脑缺血大鼠产生以下影响:(1)其脑组织中脑梗死体积减少、细胞固缩和异常增生减轻。(2)有效改善大鼠LudmilaBelayev12分评分,前肢踩空实验评分,网屏实验评分。(3)可上调 p-JAK2,p-STAT3 蛋白,同时上调 EPO,EpoR,JAK2,STAT3 mRNA和蛋白表达。激活EPO介导的JAK2/STAT3通路,减少细胞凋亡,保护缺血再灌注损伤脑组织,同时下调脑水肿相关蛋白AQP9 mRNA和蛋白的表达。2.缺血再灌注损伤大鼠脑组织中JAK2发挥作用的细胞位点主要在神经元,而不是星形胶质细胞。[创新点]本研究发现,针刺大脑中动脉闭塞脑缺血再灌注模型大鼠百会、足三里穴可明显减轻脑水肿、减少细胞凋亡,其机制与激活EPO介导的JAK2/STAT3通路、上调 p-JAK2,p-STAT3,EPO,EpoR,JAK2,STAT3 表达和下调 AQP9 表达密切相关。上述结果为针刺干预脑缺血提供了 JAK2/STAT3信号转导通路相关的实验证据。本研究发现,缺血再灌注损伤大鼠脑组织中JAK2发挥作用的细胞位点主要在神经元,而不是星形胶质细胞。经国内外文献检索,尚未发现电针百会和足三里穴同时对CIRI大鼠脑组织中EPO介导的JAK2/STAT3细胞通路干预机制的研究。