哮喘是常见的慢性呼吸道疾病之一,其机理的揭示仍然是生物医学领域的难题。哮喘的特征是气道重构以及气道平滑肌会发生过度收缩反应(AHR)。近年来研究发现哮喘也是和遗传相关的疾病,ADAM33基因被证实是哮喘的易感基因,在大部分哮喘患者的气道平滑肌和基底膜上表达较健康对照显著增高。诸多临床证据和实验结果表明ADAM33基因过表达与气道重塑以及气道高反应性的产生存在重要关联,而且这种关联很可能是直接通过气道平滑肌力学行为联系起来的。然而至今没有证据阐明气道平滑肌细胞生物力学行为与其ADAM33表达之间的关系。因此,我们推测ADAM33的过量表达能够通过影响气道平滑肌的力学及生物学行为来促进气道重构以及AHR的发生发展过程。我们前期研究发现sADAM33超表达能够引起气道平滑肌基础刚度以及收缩能力的显著提升,并且能够增加平滑肌在的二维基底的划痕侧向迁移能力,降低其在Transwell中跨微孔的迁移能力,证实了ADAM33的表达确实会影响气道平滑肌的力学行为,但其机理并不清楚,而且ADAM33超表达对气道平滑肌其他重要力学行为如对周期性应变、短暂拉伸响应、迁移行为和粘附能力的影响还未知。因此本研究就ADAM33超表达对气道平滑肌收缩能力、短暂拉伸响应、粘附能力和迁移行为等力学行为的影响进行了进一步研究,并对其机理进行了初步探索,这对解释哮喘发病机理以及研究有效治疗手段提供了有利参考。主要研究内容和结果如下:1)初步探索ADAM33表达影响ASMCs基础刚度、收缩能力的机制。脱血清培养48 h后sADAM33超表达显著上调了α-actin、calponin、SM-MHC这三种收缩态标志蛋白mRNA以及蛋白表达水平。进一步对ASMCs的Rho活性进行检测后发现sADAM33超表达导致pLV-ADAM33组的Rho-GTP占总Rho的比例比GFP组高一倍左右。当在培养基中加入ROCK抑制剂后发现sADAM33超标达所导致的这些调控几乎都被完全抑制了。这些研究结果表明sADAM33超表达会引起ASMCs收缩蛋白的过度积累而导致其处于超强收缩态,这一调控过程很大程度上依赖于Rho/ROCK信号通路介导。另外,我们发现sADAM33超表达的ASMCs细胞的培养基中的sADAM33浓度显著升高,将该条件培养基用于培养对照组平滑肌后发现能引起其收缩蛋白表达量的增高,从而确认sADAM33可以作为可溶蛋白发挥作用。2)ADAM33调控对ASMCs响应长期小幅拉伸及大幅短暂拉伸的影响并验证ADAM33是否是力敏感基因。经过48h、0.3Hz、5%的单轴拉伸后,sADAM33超表达会与周期性单轴应变加载产生协同作用而上调平滑肌收缩蛋白表达,特别是SM-MHC的表达。我们推测sADAM33超表达在哮喘患者气道周期性单轴应变的情况下,有可能更加促进平滑肌细胞肌球蛋白的表达以及肌球蛋白纤维的组装。促进较长的肌球蛋白纤维的形成,进而产生较大而且稳定的被动收缩,导致气道平滑肌变成收缩力更强紧张度更高的超强收缩态,从而促进AHR的产生。另外对周期拉伸状态下平滑肌的ADAM33表达的检测表明,ADAM33并不是一个严格的力敏感基因,对于周期性单轴应力刺激只在早期(24h)有一定响应。经过4s、10%的短暂大幅拉伸后的瞬间,sADAM33超表达的细胞牵引力显著高于阴性对照和ADAM33沉默的细胞,并且在整个恢复过程中都比另外两组细胞的牵引力要高,因此sADAM33超表达可能会导致平滑肌细胞在面临深呼吸带来的10%左右大幅拉伸时细胞软化程度远不如正常的平滑肌细胞,而且再硬化的速度也会大大加快。这就可能导致深呼吸软化气道平滑肌的作用被严重减弱,与哮喘患者气道中观察到的现象相一致。综合这两个模拟周期性呼吸和深呼吸的实验结果,我们认为sADAM33超表会显著促进气道重构后的平滑肌表型转变成为更强的收缩态拥有更强的收缩能力从而促进AHR的发生,对深呼吸时气道扩张带来的平滑肌软化有较强的削弱作用。3)ADAM33调控对ASMCs迁移以及粘附行为的影响。划痕迁移时sADAM33超表达并没有显著改变ASMCs迁移净距离和迁移速率,但是显著上调了其迁移效率和迁移方向角的集中程度。sADAM33超表达所导致的平滑肌划痕迁移能力增强,很可能并不是通过增加平滑肌迁移速率来实现的。而可能是通过增加细胞之间紧密连接从而更倾向于与周围细胞一起运动,呈现群体迁移的特征并增加迁移方向稳定性来实现的。单细胞迁移的数据也很好地支持了这一猜想,因为sADAM33超表达反而是降低了单细胞迁移净距离和迁移速率的。可能是因为sADAM33超表达使平滑肌转变成超强收缩态,细胞刚度变大形变能力减弱更具惰性,导致前期研究中发现的跨膜迁移能力降低。以上研究结果一方面对于我们进一步认识ADAM33在哮喘气道重构和高反应性中所起作用,并解释前期研究结果的矛盾具有重要的意义;本研究不仅在国际上首次揭示了ADAM33过表达与气道高反应及气道重构相关性的初步机理,而且对于更好地理解ADAM33基因多态性和哮喘易感这一仅停留在基因层面上的现象提供了和细胞功能相关的线索,为将来更好地理解哮喘患者气道高反应性和气道重构的机理以及寻找更好的治疗靶点提供重要线索。