细胞膜是由脂类、蛋白质以及糖类等组成的超分子体系，它与众多生命现象密切相关。细胞膜的组成复杂且各成分存在复杂的相互联系，较难对其进行直接研究。类脂双层膜作为一种最接近生物膜的动态自组装双层分子膜，具有与细胞膜骨架类似的结构，同时避开了天然细胞膜的复杂性，因而被广泛用于仿生生物膜研究。在仿生生物膜研究中，如何有效地提高磷脂双层膜的稳定性而又不改变磷脂双层膜的基本特性，是科学家们一直努力的方向。基于此，本论文主要围绕仿生生物膜研究中的两个重要问题而展开:一是如何构建具有高稳定性和长寿命的非支撑磷脂双层膜(BLMs);二是如何建立和发展在接近生理环境的条件下对非支撑双层膜结构与功能的原位研究平台。　　 本论文首先基于微纳米加工技术发展用于制备硅基纳米多孔膜的方法，探索在其上构建（功能化）纳米尺度非支撑磷脂双层膜(nano-BLMs)，结合电化学技术并发展两室原子力显微镜(AFM)方法，对磷脂双层膜的电学和力学特性进行研究;其次，改进现有“bench-top”方法制备玻璃纳米孔的方法，并利用电化学技术对孔上构建的功能化磷脂双层膜中的通道蛋白的性质进行研究。最后，构建基于硅基钯膜芯片的电化学溶液pH调控体系，为实时研究溶液pH对通道蛋白性质的影响及发展基于溶液pH的化学和生物传感的应用提供平台。主要研究内容和成果如下:　　 (1)发展胶体微球刻蚀-MEMS技术，成功制备了不同孔径的悬浮氮化硅纳米多孔膜芯片。该技术主要利用荷电聚苯乙烯球(PS)的单分散自组装并结合蒸镀Cr层作为掩模层，然后通过电感耦合等离子体(ICP)刻蚀得到氮化硅纳米洞，最后运用微机电系统(MEMS)技术刻蚀硅体，获得硅基悬浮氮化硅纳米多孔膜芯片。该技术具有较高的可行性和普适性，可通过改变组装的PS球的大小或者蒸镀的Cr层的厚度，有效地改变纳米孔径(100～700nm)，实现大面积、单分散且具有较低纵横比的纳米孔芯片的制备。此外，相对于昂贵的电子束或离子束刻蚀纳米孔技术，该技术具有低耗费、效率高的特点和优势。　　 (2)硅基纳米孔芯片上构建纳米尺度（功能化）非支撑磷脂双层膜，运用电化学技术并发展两室AFM方法，对磷脂双层膜的电学和力学特性进行研究。首先，对直径为200、400和700nm、厚度为200nm的硅基悬浮氮化硅纳米多孔膜芯片进行疏水性修饰，采用涂抹法在纳米孔芯片上构建nano-BLMs，并通过电化学阻抗谱(EIS)对磷脂膜的电学特性及孔径对膜寿命的影响进行研究。结合磷脂的荷电特性，我们提出了含“磷脂-溶液界面双电层”的新等效电路，可以很好地拟合EIS数据并可获得不同孔径的nano-BLMs的最初膜电阻和平均比电容分别为38.8-53.6GΩ和Cm-SiN=5.9μFcm-2。此外，不同孔径的nano-BLMs随时间变化的EIS数据拟合结果表明，200、400和700nmnano-BLMs膜寿命分别至少为:144、122和24h，说明膜寿命随孔径的减小而增加;其次，构建两室AFM研究平台，在接近生理环境的溶液中，利用AFM特有的定位技术对nano-BLMs进行力曲线研究。结果表明，磷脂膜膜破力、表观力常数和侧向张力都随孔径的减小而增加，这说明了孔径越小，磷脂膜受机械干扰能力越强，稳定性越高，该结果与EIS实验结果一致。最后，利用一步涂抹蛋白磷脂法，成功地实现功能化磷脂膜的快速构建，并利用EIS对其随时间变化进行研究。研究发现，功能化磷脂膜的寿命远远小于非功能化磷脂膜的寿命，这可能是由于蛋白的活动使得磷脂膜的有序性变差而导致膜的稳定性变差，并逐渐出现破裂使得离子容易穿透磷脂膜。　　 (3)改进现有“bench-top”方法制备玻璃纳米孔并在孔上构建功能化的非支撑磷脂双层膜，并利用电化学技术实现对蛋白的单通道电流及性质进行检测和研究。相比于早前的报道，本文采用钨丝和厚壁玻璃管来制备纳米孔，可避免剧毒物质氰化物的使用，同时提高玻璃纳米孔的制备成功率;其次，利用涂抹法在玻璃纳米孔上构建的BLMs并利用电化学对其性质进行研究。研究结果表明，构建的BLMs具高的膜电阻（高达75.8GΩ）和长的膜寿命（至少40天）;最后，在压力系统条件下，实现对α-HL和短杆菌肽蛋白的单通道电流检测。同时，利用脂质体囊泡融合到平板磷脂膜的方法，在不存在压力系统的条件下，将含H+-ATPase的载色体囊泡融合到磷脂双层膜，通过改变相关参数并利用电化学技术对其质子通道性质进行研究。研究结果表明:第一，融合具有一定的方向性，H+-ATPase的F(o)部分朝管外、F(1)部分朝管内。第二，质子通道对跨膜电压存在依赖性，其通道信号开放几率随着跨膜电压的增加而迅速提高，这暗示着提高跨膜电压将会有利于H+-ATPase在体外进行的ATP合成。第三，质子通道对质子浓度梯度存在依赖性，其通道信号开放几率随着管外（F(o)侧，trans）溶液pH值的增加而降低，这也暗示着在保障酶活性的前提下，适当地降低F(o)侧溶液pH值将会有利于H+-ATPase在体外进行的ATP合成。　　 (4)设计并搭建了基于钯膜芯片的立式串联双室电解池的电化学溶液pH调控平台，该平台可在不改变体积、不需要添加额外物质、不产生氢气和氧气的情况下，进行高效、快速、实时的溶液pH循环调控。利用电化学技术并结合Pd-HpH指示电极，实现了溶液pH值在3.4-10.5范围内的循环变化和实时检测;利用电化学并结合酸碱荧光指示剂，实现了溶液pH调变过程中的实时荧光成像。相比于本组前期使用的25μm商业化钯膜，氢原子通过200nm厚度的悬浮钯膜芯片所需的时间至少缩短100倍。总之，理论估算和实验结果皆表明，200nm厚度的悬浮钯膜芯片具有透氢速率高的特点，可使得H+很快地从串联双室电解池中的一室到达另一室，实现溶液pH的快速调节。