人骨髓间质干细胞来源exosomes分离鉴定及其对肿瘤细胞生长作用

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目的:分离培养人骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),建立MSCs来源外切体(MSC-exosomes)分离纯化方法,鉴定MSCs来源的exosomes并初步分析其生物学特性;体内外研究MSC—exosomes对肿瘤细胞生长的影响。   方法:采用ficoll密度梯度离心法分离培养人骨髓MSCs;利用超滤及梯度离心法从MSCs培养上清中分离并纯化MSC-exosomes,通过透射电镜进行形态观察及Western-blot检测exosomes表面相关蛋白CD9、CD81对其进行鉴定;将分离纯化的MSC-exosomes与肿瘤细胞SGC-7901进行BALB/c裸鼠皮下共注射建立皮下致瘤模型,通过观察比较致瘤效果和瘤体积的大小来研究MSC-exosomes在体内对肿瘤生长的影响;综合运用组织病理学、免疫组织化学、Western blotting及RT-PCR等技术比较MSC-exosomes与SGC-7901细胞共注射组与对照组瘤组织的特性;分别采用MTT法及流式细胞术测定不同浓度的MSC-exosomes作用SGC-7901细胞后其增殖活性及细胞周期的改变来研究exosomes在体外对肿瘤细胞的生长作用,并通过RT-PCR及Western blotting检测肿瘤血管生长及细胞增殖相关基因或蛋白的变化,初步探讨MSC-exosomes对肿瘤细胞作用的可能机制。   结果:采用超滤及梯度离心法成功分离纯化得到人骨髓MSCs分泌的exosomes,电镜下MSC-exosomes呈椭圆或碟状的囊泡结构,直径约40 nm~100 nm。MSC-exosomes含有其来源MSCs的成分及特征,并表达exosomes相关蛋白CD9、CD81;裸鼠皮下致瘤模型发现MSC-exosomes与SGC-7901共注射组肿瘤的生长速度较MSCs与SGC-7901共注射组相似,比SGC-7901单独接种组肿瘤生长速度明显加快。各组肿瘤组织HE染色及α-SMA,VEGF,CD34,FⅧ及PCNA免疫组化染色结果显示MSC-exosomes与肿瘤细胞共注射组的瘤组织含有丰富的血管。体外Western blotting检测表明MSC-exosomes能够引起肿瘤细胞ERK的瞬时活化,但MTT分析及流式细胞术检测细胞周期结果表明MSC-exosomes体外作用SGC-7901细胞后其细胞数量及细胞在G0/G1、S及G2/M各阶段的比例与未处理的SGC-7901细胞相比无明显差异。   结论:采用超滤及梯度离心法可以成功从间质干细胞培养上清中分离纯化exosomes。人骨髓MSCs来源的exosomes在体内能够通过促进肿瘤血管形成及肿瘤细胞增殖,进而在体内促进肿瘤生长。这将为MSCs体内促进肿瘤生长机制及肿瘤微环境靶向治疗提供实验依据。
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