目的:肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)是一种能够引起肺炎、中耳炎、败血症、脑膜炎等一系列疾病的主要病原微生物之一,对于儿童和老年人的危害尤为突出。疫苗是预防和控制肺炎链球菌感染的一种有效手段。目前上市的有23价荚膜多糖疫苗和7~13价荚膜多糖结合疫苗,但它们存在免疫原性弱、血清型覆盖不广或易引起荚膜血清型转换等缺点。因此,研制新型的、更理想的S.pn疫苗已成为预防其感染的一项重要课题。肺炎链球菌减毒活疫苗SPY1是本课题组前期获得的一株2型肺炎链球菌D39的突变菌株。该菌株没有荚膜且毒力显著降低,作为疫苗免疫小鼠后,安全性较高、保护效果好,甚至优于目前上市的疫苗。而且其保护作用不依赖于荚膜的存在,因此对于各种血清型的肺炎链球菌都有抵抗作用,属于血清型非依赖型疫苗,具有进一步开发的潜质。然而,该疫苗存在大多数疫苗共有的缺点即热稳定性差,需要冷藏保存,并且该疫苗免疫原性不强,需要佐剂辅助才能发挥良好的免疫保护作用。有文献报道,采用仿生矿化技术在活酵母细胞和病毒表面形成一矿化层后,其热稳定性和免疫原性均得以提高,但尚未见到对活细菌疫苗进行矿化的报道。因此,本研究旨在对SPY1进行原位矿化,进而提高SPY1的热稳定性及其免疫原性,并进一步对其免疫保护效果及机制进行初步探究,为肺炎链球菌活菌疫苗的进一步研发奠定基础。方法:以肺炎链球菌d39基因组dna为模板设计合成构建突变体lyta基因所需引物,采用插入失活的方法构建spy1-△lyta突变株,并以缺陷菌的生长特性以及pcr的方法进行鉴定;将spy1-△lyta突变株于富钙环境中培养,用不同浓度的磷酸盐进行滴定,使其形成磷酸钙矿化壳,通过扫描电镜以及直接荧光反应来检测疫苗菌株矿化情况;并将矿化菌株与未矿化菌株同时置于37℃环境条件下,通过比较各组细菌在不同时间点的存活量来评价矿化菌的热稳定性;将矿化菌株spy1-△lyta-capi黏膜免疫c57bl/6小鼠,从免疫后小鼠抗肺炎链球菌鼻腔定植的能力初步评估其保护效果,通过检测免疫后小鼠体内的抗原特异性igg及细胞因子水平,初步探究该矿化疫苗的免疫保护机制。结果:pcr结果以及细菌长时间不溶解的生长特性表明成功构建了spy1-△lyta突变株;扫描电镜以及直接荧光反应结果显示细菌表面形成capi矿化外壳,并且spy1-△lyta-capi矿化菌具有较好的热稳定性;黏膜免疫c57bl/6小鼠后,与未矿化疫苗组相比,矿化疫苗spy1-△lyta-capi可以降低肺炎链球菌19f在小鼠鼻腔内的定植,并且可以刺激高水平的il-17a、il-10产生,提示该矿化疫苗可以引起th17以及treg型细胞免疫应答,初步显现了较好的免疫保护效果。结论:成功构建了肺炎链球菌减毒活疫苗spy1(无自溶活性)的矿化菌株,不仅提高了疫苗菌株spy1的自身稳定性和热稳定性,使得该疫苗脱离冷链运输成为可能,同时还提高了SPY1的免疫原性,使其在可以不依赖佐剂的情况下,达到良好的免疫保护效果,可谓一举两得。该新型矿化疫苗的研制及其免疫效果的初步评价将进一步推进肺炎链球菌减毒活疫苗的研发和应用进程,同时也为研究高效稳定的其他活菌疫苗提供新的思路。