大菱鲆(Scophthalmus maximus)在分类学上属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲽形目(Pleuronectiformes)、鲽亚目(Pleuronectoidei)、鲆科(Bothidae)、菱鲆属(Scophthalmus),为原产于欧洲的名贵经济鱼类,英文名为turbot,在我国俗称“多宝鱼”,是重要的海水经济增养殖鱼类之一。近年来,由于环境污染的日益加剧和养殖业的过度膨胀,各种传染性疾病尤其是病毒病开始广泛传播,病毒性疾病危害最大,并且极难防治。大菱鲆红体病是近年来对大菱鲆养殖业危害较大的一种病毒性疾病,其病原为大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot rddish body iridovirus,TRBIV)。大菱鲆死亡率逐年上升,给大菱鲆养殖业带来了巨大的经济损失。从根本上解决和预防大菱鲆病毒病的关键是要查清病毒的感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗对大菱鲆进行免疫预防,而建立新的大菱鲆细胞系是进行病毒研究的理想体外研究体系和制备病毒疫苗的有效方法。本文采用胰蛋白酶、透明质酸酶和Ⅱ型胶原酶消化法成功启动了大菱鲆肝组织的原代培养,原代培养启动一周后,组织块周围即有大量的细胞迁出,形成明显的生长晕,30天后便可长成细胞单层。通过比较DMEM/F-12和L-15两种培养液,发现DMEM/F-12更适合大菱鲆肝细胞的体外培养。确定了大菱鲆肝细胞的最适培养体系为:20℃下,pH值7.0,添加50μg/mL羧甲基壳多糖、50μg/mL N-乙酰葡萄糖盐酸盐、10ng/mL表皮生长因子(EGF)、10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和20%胎牛血清的DMEM/F-12培养液。经继代培养后,已传至32代。病毒感染体外培养细胞引起的细胞病变效应(cytopathic effects, CPE),是病毒在细胞内增殖的一个重要检测指标。本文利用TRBIV的敏感性细胞牙鲆腮细胞(Flounder gill,FG)为繁殖体系,以CPE为判断指标,对分离制备的TRBIV进行了鉴定,并测定其血凝效价作为病毒含量的标准,同时进行了体外最适繁殖条件如病毒接种量,吸附时间及细胞培养条件等的研究。结果表明,病毒接种量、病毒吸附时间、细胞培养条件均对TRBIV的体外繁殖产生明显的影响,如下繁殖条件可使病毒的繁殖速度最快:0.2 mL病毒液(血凝效价为1:64)接种于FG细胞,进行2h吸附后补加10%胎牛血清-MEM培养液,置22oC培养。另外还发现,病毒的感染力均受到病毒的收获时间和病毒液冻融次数的显著影响,在最佳繁殖条件下,收获在细胞中繁殖至第4天的病毒,且只冻融1次,可使其保持最强的感染活力,反复冻融会使病毒的感染活力显著降低。TRBIV的繁殖及其收获条件的确定,为后续大菱鲆病毒疫苗的研制奠定了基础。在TRBIV的体外最适繁殖条件下,对TRBIV进行了大量增殖,利用传统的甲醛灭活法制备TRBIV灭活疫苗,加入终浓度为0.1%福尔马林,于37℃进行灭活处理48小时,即获得灭活TRBIV疫苗原液,置4℃保存,待使用时再行稀释并加入终浓度为5mg/mL的Al(OH)3佐剂,制成灭活TRBIV疫苗使用液。对TRBIV疫苗的安全性检测结果显示,灭活TRBIV疫苗液不会引起FG细胞病变,也不会造成健康正常大菱鲆染病,证明所得病毒疫苗已被有效灭活,具有高度安全性,可用于大菱鲆的预防免疫。TRBIV疫苗对大菱鲆的免疫保护力检测结果证明,实验室内注射灭活TRBIV疫苗对10尾大菱鲆的免疫保护率为90%,养殖场内浸泡灭活TRBIV疫苗对两个养殖场中50万尾和200万尾大菱鲆的免疫保护率分别为83%和85%,证明所得灭活TRBIV疫苗对大菱鲆具有极高的免疫保护率;血清抗体检测结果显示,TRBIV疫苗接种8天后,大菱鲆体内血清的血凝抑制效价为1∶20,表明TRBIV疫苗诱导大菱鲆产生了抗TRBIV的抗体,可显著增强抗TRBIV感染的免疫力。