【摘 要】
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所有卟啉类化合物生物合成共有途径由三个酶催化,它们分别是 5-氨基酮戊酸脱水酶(5-aminolevulinate dehydrates, ALAD),胆色素原脱氨酶(Porphobilinogen deaminase,PBGD)和
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所有卟啉类化合物生物合成共有途径由三个酶催化,它们分别是 5-氨基酮戊酸脱水酶(5-aminolevulinate dehydrates, ALAD),胆色素原脱氨酶(Porphobilinogen deaminase,PBGD)和尿卟啉原 III 合酶。PBGD 是共有途径的调控酶。为研究豌豆胆色素脱氨酶在大肠杆菌的高效表达,本实验构建了 PBGD 的 T5 启动子下的双标签表达载体 pQE30PBGD 和 T7 启动子下的双标签表达载体 p28PBGD,双标签分别为组氨酸标签和抗链霉素蛋白短肽标签。为确定酶的保守氨基酸残基 Ala188 对酶活的贡献,本实验将 Ala188 突变成 Ser188,测序验证。为防止 PBGD 催化的产物尿卟啉原I 毒害转化细胞,将枯草杆菌 UROS 的表达载体和 p28PBGD 共转化。为调控 PBGD的表达,我们又将合成胆色素原(PBGD 辅基成分)的 5-氨基酮戊酸脱水酶的表达载体和 p28PBGD 共转化。分别诱导表达 p28PBG/pA-ALAD 和 p28PBGD/pA-UROS,Ni-NTA 亲和层析柱纯化。结果如下: 1. 构建了 T5 启动子下的 pQE30sPBGD 和 T7 启动子下的 p28PBGD 表达载体,表达重组豌豆胆色素脱氨酶,它的 C-端含有 8 个氨基酸短肽的 strep 标签,N-端含有组氨酸标签。 2.定点突变胆色素原脱氨酶保守氨基酸 A188S。 3.分别将胆色素原脱氨酶的上游和下游的两个酶 5-氨基酮戊酸脱水酶和尿卟啉原 III合酶,插入 pET-3a,再将酶切的含 T7 启动子和 RBS 序列的两个酶的基因序列插入 pCYC184 中。 4.S 分别诱导表达 p28PBG/pA-ALAD BL21(DE3)和 p28PBGD/pA-UROS DS-PAGE BL21(DE3),SDS-PAG 电泳表明豌豆胆色素原脱氨酶纯化有一条主带,分子量约为44Kd。
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