丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)为正链RNA病毒，已知其基因组两端的非编码区(non-coding region，NCR，又称为非翻译区UTR)对病毒翻译复制十分重要，其中3’NCR区为病毒RNA复制起始区，且能增强病毒IRES介导的翻译，已发现多种细胞蛋白可以与其结合从而参与调节HCV复制、翻译，而对其互补链5’(-)NCR的研究目前几乎空白。　　 为发现新的与HCV3’NCR及其互补链5’(-)NCR结合的细胞蛋白，本研究利用体外转录并标记生物素的上述RNA片段对能支持HCV有效复制的Huh7细胞的胞浆蛋白组分S10进行RNA pull-down实验；随后利用蛋白质一维SDS-PAGE电泳结合液相色谱-质谱联用(1DE/LC/MS)以及二维电泳结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(2DE/MALDI-TOF-MS)两种方法对得到的蛋白复合物进行全面的分析，获得了结合蛋白谱；综合分析上述结合蛋白谱，在去除载体RNA对照组中也出现的非特异性结合蛋白后，共有10个特异性结合蛋白同时为两种鉴定方法所发现，包括6个HCV3’NCR结合蛋白、3个5’(-)NCR结合蛋白以及同时结合这两个RNA片段的DDX1蛋白；对其中的5’(-)NCR结合蛋白G3BP1、3’NCR结合蛋白PCBP2以及DDX1设计特异性siRNA，在复制子中分别干扰它们的表达后观察对HCV复制的影响，发现G3BP1表达降低后HCVRNA及蛋白水平均有明显下降(分别降低约55％和57％)，提示该蛋白可能参与HCV复制。　　 因此本研究对G3BP1调控HCV复制进行了深入研究。首先确认G3BP1与HCV5’(-)NCR RNA的相互作用并分析结合位点：通过RNA pull-down实验证实G3BP1可与HCV5’(-)NCR结合并发现5’(-)NCR最前端98nt的保守区含有G3BP1的结合位点；进一步构建了G3BP1 C端RNA结合功能域缺失的截短突变体，研究它们同HCV5’(-)NCR RNA的结合情况，结果显示G3BP1通过其C端的RNA结合域RRM和RGG box结合HCV5’(-)NCR RNA。　　 随后通过一系列实验从多个方面证实G3BP1为HCV复制复合体(HCVreplication complexes，HCV RC)成分，在细胞内同样可能结合HCV负链5’(-)NCR：免疫共沉淀实验发现单独表达时G3BP1只同HCV NS5B共沉而不结合NS3及NS5A，但在复制子细胞中G3BP1可以将上述三个HCV RC成分蛋白都共沉淀；免疫荧光共聚焦实验发现复制子中G3BP1同HCV RC成分蛋白NS5A共定位且呈脂滴状分布于近核周，与文献报道的HCV RC分布情况一致；用脂筏删除试剂mβ CD处理细胞使HCV RC解离后G3BP1同NS5A的共定位也随之消失；蛋白酶K处理实验证实复制子中G3BP1同HCVRC成分蛋白具有相同特性，可以耐受蛋白酶K处理，进一步提示G3BP1为HCV复制复合体一部分。　　 为验证G3BP1在HCV复制中的作用，进一步用特异性siRNA抑制G3BP1在不同细胞中的表达，HCV亚基因组复制予克隆形成实验以及HCV感染性颗粒(HCVcc)感染实验均证实：当siRNA干扰了细胞中G3BP1的表达后HCV复制几乎全部被抑制。随后构建了一系列G3BP1各功能域缺失的截短突变体，在亚基因组复制子以及HCVcc系统中观察这些突变体对HCV复制的影响。结果显示G3BP1 C端RNA结合域。RRM和RGG box是其参与HCV复制所需的。此外，应用IRES介导的报告基因系统发现si-G3BP1并不影响HCV IRES介导的翻译。上述结果从功能学角度进一步证明G3BP1是HCV复制复合体成分，为HCV复制所必需。　　 最后对G3BP1参与HCV RNA复制进行了初步研究：在siRNA干扰G3BP1表达后的细胞中电转HCV BB7亚基因组复制子RNA或感染HCVcc，不同时间点检测HCV正负链RNA累积情况，结果提示G3BP1可能在HCV负链合成过程中起促进作用。　　 综上所述，本文利用RNA pull-down结合生物质谱的方法发现了数个新的与HCV3’NCR及其互补链5’(-)NCR特异性结合的细胞蛋白；在确认G3BP1同5’(-)NCR相互作用的基础上深入研究了G3BP1参与HCV复制的机制，为进一步了解HCV复制机制和研制抗HCV药物打下了良好的基础。