利用酵母双杂交系统筛选与果蝇C(2)M相互作用的蛋白

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果蝇作为经典的模式生物,不仅在经典遗传学中得到广泛应用,其许多分子机制在进化上与哺乳动物是高度保守的,尤其在卵子发生这一系统中。相对于其他模式生物而言,果蝇具有相对简单的发育过程。我们希望通过对果蝇生殖系统的研究,来揭示减数分裂早期事件,提高我们对减数分裂的认识。  联会复合体(SC)是由减数分裂前期Ⅰ中各种蛋白成分装配形成的一种超级复合结构,它是由LEs、TFs和CE三种成分共同组成。它起始于减数分裂前期Ⅰ的偶线期,于双线期开始解体。联会复合体正常的装配和解体,对于同源染色体的配对、联会、交叉互换以及染色体的分离是必需的。  C(2)M作为减数分裂特异性蛋白,参与SC的装配。根据分子实验和生物信息学分析,它既同C(3)G共同形成LE元件,参与C(3)G的定位;又与α-kleisin蛋白家族具有相似的功能:与cohesin蛋白家族相互作用,连接SMC1和SMC3,聚集姐妹染色单体。对于卵子的形成发挥着重要的作用。由于联会只发生在减数分裂Ⅰ期,持续时间短,并且结构微小,以目前的分辨率还无法观察到SC的结构。C(2)M作为SC结构的组成成分,我们希望从这一点入手,探究与C(2)M相互作用的蛋白,试图揭示SC复合体的组成、装配,以及减数分裂的分子过程。  我们选取C(2)M为诱饵蛋白,设计引物以果蝇cDNA为模板,PCR扩增C(2)M的CDS区,并以NcoⅠ和XhoⅠ构建了pGBKT-7-C(2)M这一表达载体。通过LiAc溶液介导转入酵母细胞中,并用Western检测诱饵蛋白在酵母AH109菌株中是否表达,在SD/-Ade/-Leu/-Trp和SD/-His/-Ade/-Leu/-Trp缺陷培养基上检测诱饵蛋白是否能自激活报告基因的表达。将文库质粒转入含诱饵质粒的AH109中,通过SD/-His/-Ade/-Leu/-Trp缺陷培养基的筛选,挑出文库中与C(2)M相互作用的蛋白质。并提取所有阳性酵母克隆的质粒,将其转入大肠杆菌细胞中,扩增文库质粒。将所得的阳性文库质粒回转含pGBKT-7-C(2)M质粒的AH109中,验证相互作用;以及回转含pGBKT-7空载质粒的AH109中,验证阳性文库质粒的自激活现象。最后,我们将既能通过回复验证、又没有自激活现象的阳性文库质粒送去生物公司测序,并经过生物信息学分析,排除杂蛋白的干扰。结合文献及现有资料,从中选取两个基因构建转基因果蝇,在生殖细胞中进行了RNA水平的敲低,通过染色观察这两个基因对减数分裂的影响。  通过酵母双杂实验,我们共挑出154个克隆,去除9个回复验证失败和54个自激活组别后,得到91个阳性克隆。测序后,将这91个克隆在NCBI上比对,得到40个与C(2)M存在相互作用的蛋白,这其中包括众多的染色质结合蛋白。对Wech和Psf1这两个基因在生殖细胞中进行了RNA水平的敲低后,免疫荧光观察结果显示,在Wech和Psf1敲低的果蝇生殖细胞中,染色质的联会受到了干扰,联会复合体的消失出现延迟现象,即最后有两个细胞形成了生殖细胞。这种结果说明Wech和Psf1具有促进联会复合体解聚的功能。
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