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目的: 模拟人的患病因素制作胃癌前病变大鼠模型,观察加味左金丸对胃癌前病变的治疗作用并从分子水平探讨其作用机理。 方法: 1.造模方法 采用改进的综合造模方法。具体如下:每日自由饮用100ug/mlMNNG(甲硝基亚硝基胍液)(饮水瓶用油漆涂黑避光),进食含0.03%雷尼替丁的纯鼠颗粒饲料,上午用56℃15%盐水按10ml/kg灌胃;进食两天、禁食一天,进食当天下午用20mmol(0.85%)脱氧胆酸钠溶液按10ml/kg灌胃,禁食当天下午用40%酒精按10ml/kg灌胃;每周用钳子夹住大鼠的尾部一次,使之保持激怒、争斗状态,持续30分钟。上述方法连续造模24周。24周末时随机抽取正常组和造模大鼠各一只,杀检,观察组织病理学变化(以HE染色光学显微镜下观察的结果为主),确认模型是否成功。 2.动物分组 SPF级6周龄Wistar雄性大鼠60只,随机抽取10只作为正常对照组(简称正常组)(n=10),余下的50只造模,取其中造模成功的43只(另7只中,1只为正常按时杀检,6只为死亡)随机分为模型对照组(简称模型组)(n=11)、维甲酸组(n=8)、加味左金丸高剂量组(简称高剂量组)(n=8)、加味左金丸中剂量组(简称中剂量组)(n=8)、加味左金丸低剂量组(简称低剂量组)(n=8)。 3.给药剂量 造模24周后即造模成功后,正常组不作任何处理,模型组大鼠每日按10ml/kg灌胃蒸馏水;加味左金丸高、中、低剂量组每日分别给于200%、100%、50%不同浓度的加味左金丸药液10ml/kg灌胃;维甲酸组按10ml/kg灌胃。每日一次,连续16周。 4.观察指标 ①一般情况:观察各组大鼠进食、饮水、精神状态、形体、活动情况、被毛光泽度、大便情况及存活情况。②体重:从实验开始,每月称取体重一次,并计算给药前后各组大鼠体重的平均值,进行统计学比较。③胃粘膜肉眼观察:观察给药前后各组大鼠胃粘膜色泽、皱壁排列、炎症情况及胃壁的伸展性等。④胃粘膜HE染色光学显微镜下观察:观察各组大鼠给药前后胃粘膜的病理组织学改变,计数各组浅表性胃炎(CSG)、萎缩性胃炎(CAG)、肠上皮化生(IM)、不典型增生(ATP)和增生结节发生例数。胃粘膜组织学改变的诊断标准参照实验性胃腺癌的分类和诊断标准。实验过程中死亡的大鼠不进行组织学观察和统计分析。⑤免疫组织化学染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)并计算增殖指数(PI)。⑥免疫组织化学染色检测表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子受体(C-met)、凋亡抑制因子-2(Bcl-2)等癌基因蛋白表达情况。⑦免疫组织化学染色检测环氧合酶—2(COX-2)、端粒酶催化活性亚单位(h-TERT)。⑧原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞并计算凋亡指数(AI)。 结果: 1.一般情况湖北中医学院博士学位论文加味左金丸治疗胃癌前病变大鼠的作用机理研究(胡运莲) 造模大鼠在造模开始后8周即开始出现活动量、食量、体重、被毛、大便等方面的变化,至24周时(即模型成功时)上述改变更加明显;模型组大鼠形体消瘦,活动减少,被毛无光泽,食量少,大便稀塘;加味左金丸高、中、低剂量组上述表现均不同程度好转,食量和活动增加,体重上升,大便成形;维甲酸组大鼠食量有所增加,但被毛欠光泽,体重有所上升,大便成形。 加味左金丸高、中、低剂量组①均能增加模型大鼠的食量、体重和改善被毛、大便等一般情况,与模型组比较有极显著性差异(P<。.01),与维甲酸组比较有显著性差异(P<0 .05);②明显降低模型大鼠的死亡率,模型组的死亡率54 .55%,加味左金丸高、中、低剂量组和维甲酸组死亡率为。,与前者比较有极显著性差异(P<0 .01)。 2.病理学变化 (1)肉眼观察:造模24周时,模型大鼠胃腔变形,胃粘膜呈灰白色,胃壁增厚,伸展性差,粘膜皱壁紊乱。实验结束时,模型组大鼠胃粘膜黄染,皱壁平坦,存活5例中有2例出现增生结节,1例位于十二指肠,如黄豆大小,呈菜花状,质硬(组织学检查为早期腺癌),1例位于胃窦部,如绿豆大小,圆形,质中(组织学检查为增生性息肉);维甲酸组大鼠粘膜较暗淡,较正常粘膜变薄,未见增生结节;加味左金丸高、中、低剂量组大鼠粘膜呈粉红色,皱壁排列规则,未见增生结节。 (2) HE染色光学显微镜下观察:①加味左金丸高、中、(低剂量组能改善模型大鼠csG、cAG胃粘膜炎症,与模型组比较有显著性差异(P<0 .05),与维甲酸组比较无显著性差异(P>0 .05夕,仅中剂量组在改善模型大鼠csG方面优于维甲酸组(P<0 .05);②加味左金丸高、中、低剂量组降低模型大鼠IM、ATP的发生率,与模型组比较,高、低剂量组有显著性差异(P<0 .05),中剂量组有极显著性差异(P<o.。功扩与维甲酸组比较,加味左金丸高、中、低剂量组均无显著性差异 (P>0 .05)。, 3 .PcNA及EGFR、vEGF、C一爬七癌基因蛋白的表达情况 ①PcNA染色阳性定位于细胞核。正常大鼠胃粘膜增生带细胞可见PcNA阳性细胞,但其PI与模型组比较有极显著性差异(P<0 .01);加味左金丸高、中、低剂量组及维甲酸组PI与模型组比较有极显著性差异(P<0 .01);加味左金丸高、中、低剂量组与维甲酸比较有显著性差异(P<0 .05),与正常组比较无显著性差异(P>0 .05),加味左金丸低、中、高剂量组之间无显著性差异(P>0 .05)。 ②EGFR染色阳性定位于胞浆及胞